谷物种子蛋白质中赖氨酸含量的测定.doc

谷物种子蛋白质中赖氨酸含量的测定一、实验目的掌握茚三酮比色法测定氨基酸含量的原理和方法,测定谷物种子蛋白质中赖氨酸含量。二、实验原理蛋白质中的赖氨酸具有一个游离的-NH2，它与茚三酮试剂反应生成蓝紫色物质，其颜色的深浅在一定范围内与赖氨酸的含量成线性关系。因此，用已知浓度的游离氨基酸制作标准曲线，通过比色分析（530nm）即可测定出样品中的赖氨酸含量。亮氨酸与赖氨酸的碳原子数目相同，而且仅有个游离氨基(-NH2)，所以通常用亮氨酸配制标准液。但由于这两种氨基酸分子质量不同，以亮氨酸为标准计算赖氨酸含量时，应乘以校正系数1.1515，最后再减去样品中游离氨基酸含量。三、实验仪器1电子分析天平（1/1000）、可见分光光度计、恒温水浴箱、干燥器、移液器。2试管架（塑及铝）、具塞试管、具塞三角瓶、细口瓶、漏斗（或0.45um滤膜）、吸管等。四、实验试剂10.4mol/L柠檬酸缓冲液：称取4.202g柠檬酸和5.88g柠檬酸三钠，溶于100ml蒸馏水中。2 茚三酮试剂：称40mg二氯化锡(防腐)溶于25ml柠檬酸缓冲液中；称lg茚三酮溶于25ml 95乙醇中；将上述两液混合摇匀，滤去沉淀，上清液置冰箱中保存备用。30.02mol/L盐酸：取12mol/L盐酸0.17ml，用蒸馏水稀释定容至100ml。4亮氨酸标准液：准确称取20mg亮氨酸，加数滴0.02mol/L盐酸使之溶解，然后用蒸馏水稀释定容到100ml，则得浓度为200gml的标准液。560乙醇。64碳酸钠：称取4g无水碳酸钠，溶于100 ml蒸馏水。72碳酸钠。五、操作步骤1标准曲线的制作。取7支具塞试管，按表进行编号、加入试剂，顺序操作。以第1管为空白，在530nm波长下比色，读取吸光度值。并以吸光度值为纵坐标，亮氨酸含量（g）为横坐标，绘制标准曲线。2样品前处理不同品种的玉米种子，用粉碎机粉碎，过80100目筛子，收集过筛后的细粉，放入广口瓶中，加入沸程6090 的石油醚，使其淹过粉面，浸泡8小时，不时摇动进行脱脂。然后过滤，并用石油醚淋洗沉淀若干次，弃去滤液。将脱脂玉米粉凉在干净的滤纸上，置阴凉通风处吹干石油醚。收集干粉，置于干燥器内，保存备用。3样品的测定取15mg已粉碎脱脂的玉米样品于具塞干燥试管内，加2碳酸钠1.0ml，于80水浴中提取20min，然后加茚三酮试剂2.Oml，继续保温显色30min，冷却后加60乙醇3.Oml，混匀后过滤或离心，然后在530nm波长下比色。六、实验结果样品中赖氨酸的含量（%）=从标准曲线上查得值（g）10-3/(样品重mg)1.1515100%-C校正系数：1.1515；C：游离的氨基酸含量七、注意事项1各种作物种子中游离氨基酸含量是：玉米0.01、小麦0.05、水稻0.01、高粮0.04。2茚三酮显色反应受温度、pH、时间影响较大，如果要使实验结果能很好重复，必须严格控制上述条件。样品中如含有大量盐酸会使氨基酸不易显色。标准曲线的制作及样品测定参考表试 管号试 剂1#(空白)2#3#4#5#6#7#(样品)亮氨酸标准液(ml)00.10.20.30.40.5蒸馏水(ml)0.50.40.30.20.10亮氨酸含量(g)0204060801004碳酸钠(ml)0.50.50.50.50.50.5脱脂样品(mg)152碳酸钠(ml)1.080水浴20分钟茚三酮试剂(ml)2.02.02.02.02.02.02.0混匀，加塞，80水浴30分钟，冷却至室温60乙醇(ml)3.03.03.03.03.03.03.0过滤混匀A530蛋白质中赖氨酸（lysine，Lys）的含量是谷物品质的主要指标之一。由于动物及人类不能合成，须从食物中得以补充，为此培育高含量赖氨酸的谷物，对于提高营养价值有重要意义。本实验分别用茚三酮溶液显色法和染料结合法（Dye Binding Lysine，DBL）测玉米种子中赖氨酸含量。一、茚三酮显色法原理： 谷物蛋白中赖氨酸残基有自由的-NH2，它与茚三酮（ninhydrin）试剂可发生颜色反应，生成紫红色物质，其颜色与赖氨酸残基的数目成正相关。选用碳原子数目与赖氨酸相同的亮氨酸，配成标准溶液，做出标准曲线，可用以测定谷物蛋白内赖氨酸的含量.二、材料、仪器设备（一）材料：不同品种的玉米种子，用粉碎机粉碎，过100目筛子，收集过筛后的细粉，放入广口瓶内，加入沸程6090的石油醚，使其淹过粉面，浸泡8h，不时搅动进行脱脂。然后过滤，并用石油醚淋洗沉淀若干次，弃去滤液。将脱脂玉米粉晾在干净的滤纸上，置阴凉通风处吹干石油醚。收集干粉，置干燥器内，保存备用。（二）仪器设备：1. 722型分光光度计；2. 水浴锅；3. 试管；4. 圆头玻璃棒（圆头大小要与试管大小配套）。（三）试剂：1. 缓冲溶液，称取30g甲酸钠，溶解于约60ml蒸馏水中，加入10ml8的甲酸，最后加水到1