药物设计学 第11章.ppt

第十一章基于片断的药物设计Fragment baseddrugdiscoveryFBDD 魏丹丹 学习要求 掌握 基于片段药物设计的基本思路 基于片段药物设计的优点 片段筛选的主要检测技术 片段优化的常用方法 熟悉 磁共振检测技术的分类和原理 SAR by NMR的原理和应用 Tether和二次Tether技术的原理 结晶筛选的研究流程 了解 基于片段药物设计的发展历史 基于片段药物设计与高通量筛选的比较 基于片段药物设计的成功实例 FromLeachAR HannMM BurrowsJNetal Fragmentscreening anintroduction Mol BioSyst 2006 2 429 446 对靶标认识水平不同的药物分子设计 苗头和先导物的发现途径 天然活性物质基于结构的分子设计随机筛选虚拟筛选 问题的出现 以靶标为核心的新药研发 切入点是用体外方法评价活性 苗头化合物 hit 多以活性强度为衡量标准 hit to lead和先导物优化 大都加入或变换基团 以增加与靶标结合的机会和强度 一般 不敢 去除基团或片断 以免丢失参与结合的原子或基团 即药效团 高通量筛选的化合物过于 成熟 留给后续的结构变换的余地小 导致投入 产出比低 基于片段分子设计的优点 高通量筛选的不足 发现苗头的概率很低 理论计算 含有30个C N O S原子的化合物有1060种 而高通量筛选的化合物数即使以百万计 106 筛选也只占很少部分 化合物分子量比较大 亲脂性强 优化成药的难度大 组合化学库尤甚 1 可以探索更为广阔的空间 片段分子 符合三规则的片段数目的分子量 160的含上述原子化合物数为107 筛选的分子 片段库 为103 104个 发现苗头的几率高 公司之间的化合物的结构类型相似 筛选靶标相同 易有知识产权之纠葛 2 命中率高片段分子具有体积小和复杂程度低的特征 理论上更加容易与药靶结合 加上片段筛选技术的灵敏度高 因此具有比较高的筛选命中率 基于片段筛选的命中率是高通量筛选的10 1000倍 从筛选的质量上看 高通量筛选所得到的活性化合物虽然可能和药靶具有比较高的亲和力 但是当具体到分子中各个子结构 他们很难与对应的药靶活性位点区域有最佳的结合 分子量比较低的片段分子相对比较容易能和药靶局部区域形成较好的匹配 0 100 200 300 400 500 600 700 1mM 100 M1 M10nM1nM 药物 HTS苗头物 药物候选物 片断化合物 药效强度 相对分子质量 Reesetal NatureRev DrugDisc 2004 上市的口服药物平均分子量为340 处于I期临床试验的候选药物 分子量小于400的成功率为50 分子量加大 成功率降低 FragmentRuleof3MW 300 H BondDonor 3 H BondAcceptors 3cLogP 3 Rotatablebonds 3 3 发现新药的可行性高 高通量筛选所得化合物的分子量范围一般在250 600之间 高通量筛选活性一般在微摩尔级 而药物分子的分子量范围一般在300 500之间 活性一般为一至数十个钠摩尔 如果将高通量筛选所得活性化合物优化为候选新药 既要在活性方面有较大幅度的提高 而分子量又不能有过大的跳跃 难度显然比较大 而片段的分子量范围在120 250 活性一般在钠摩尔至微摩尔级 在片段优化至候选药物的优化过程中 分子量和生物活性呈线性增长关系 更加符合新药发现的一般规律 可行性也强 高通量筛选 高通量筛选 Highthroughputscreening HTS 技术是指以分子水平和细胞水平的实验方法为基础 以微板形式作为实验工具载体 以自动化操作系统执行试验过程 以灵敏快速的检测仪器采集实验结果数据 以计算机分析处理实验数据 在同一时间检测数以千万的样品 并以得到的相应数据库支持运转的技术体系 HTS具有微量 快速 灵敏和准确等特点 简言之就是可以通过一次实验获得大量的信息 并从中找到有价值的信息 片断及其特征 片断是比类药分子小的化合物 分子量或非氢原子数低于类药性化合物 化学结构比类药分子简单 片断应易溶于水 因需要高浓度试液方呈现与靶标的结合信号 结构上有可以延伸的位置 原子或基团 基于片断分子设计的研究方法 一般来说 基于片段分子的设计研究可以分为三个阶段 片段筛选 片段与药靶复合物的结构确证和基于片段构建新分子 1 片段库的建立 需要考虑三个因素 库容量 化学结构多样性和类药性 类药性符合三规则 FragmentRuleof3MW 300 H BondDonor 3 H BondAcceptors 3cLogP 3 Rotatablebonds 3 2 片段库的筛选 筛选和识别与靶蛋白弱结合的活性片段 3 结构信息的确定磁共振 质谱和X 射线单晶衍射技术都能直接或者间接地进行结构信息的测定 4 基于片段构建新分子 由苗头物发展成先导物的性质变化 参数苗头物均值先导物均值增量分子量174 1382 8207 7氢键给体1 71 70氢键接受体2 95 62 7非氢原子数12 828 515 7 增量大 由先导物发展成药物的性质变化 参数先导物均值成药后均值增量分子量272 0314 042 0氢键给体0 80 80氢键接受体2 22 50 3ClogP1 92 40 5非氢原子数19223 增量小 FBDD的背景1 Andrews分析了200个药物和抑制剂的结合常数与结构的关系 得出了10个常见功能基和原子对结合能的贡献均值 kcal mol 带电荷的基团与受体结合的贡献强于极性基团 极性基团又强于非极性基团 FBDD的背景2 Kuntz等分析了150个含有1 67个原子构成的离子或化合物与受体的结合常数 按照下式计算了结合常数与系统自由能变化的关系 进而推定出每个原子对结合的贡献 G结合 G复合物 G参比态 RTlnK 当非氢原子数在15个以内 结合能随原子数的增加而线性增高 平均每个原子的贡献为1 5kcal mol 超过15个原子后结合能的变化趋于不变 成为非线性变化 这种现象归因为非热力学因素 Andrews和Kuntz的研究为配体效率概念奠定了基础 配体效率 ligandefficiency LE 分子大小影响物化和药代性质 减少苗头 先导物中冗余原子的必要性 配体效率是衡量苗头物或先导物以及优化的化合物的质量的参数 表征化合物的活性效率 系指配体 苗头 先导物 优化物等 中每个原子对结合能的贡献 在选取先导物和优化过程中是个有用的指标 计算方法 首先是将复合物结合常数Kd转换为在温度300K的结合的自由能 G G RT lnKd 1 37pKd G除以非氢原子数 得出每个原子的自由能贡献即配体效率 用下式表示 LE G N非氢原子 配体亲脂性效率 配体效率是将化合物的活性在分子大小的尺度上加以表征 是优化过程中监测化合物的活性 物化性质和成药性程度的一个指标 还可用配体 亲脂性效率指数 ligand lipophilicityefficiency LLE 表征先导物和优化的质量 LLE的定义是pIC50 或pKi CLogP 或LogD 契合质量 在结构优化中 当分子量的加大 即使活性增大 配体效率却变化不大 甚至减小 以致不能反映和揭示优化过程的实际状态 Reynolds等提出了配体的契合质量的概念 fitquality FQ 以消除因分子量加大 LE的变化被掩饰和拉平的效应 计算方法是将化合物的非氢原子数归一和标度化 得到相应的LE Scale 分子中不同原子数 LE Scale值不同 按如下定义 LE Scale 0 064 0 873 e 0 026 HA 或将幂式展开 LE Scale 0 0715 7 5382 HA 25 7079 HA2 361 4722 HA3 FQ将上述的非线性标准化 使配体之间的结合效率有可比性 契合质量 若以非氢原子数与配体效率作图 原子数在10 25的化合物配体效率呈线性变化 当非氢原子低于20时 最大亲和力与原子数成线性关系 超过20后活性趋于不变或下降 非氢原子数LEscale相邻差值100 7204 110 69720 0232120 66850 0287130 63670 0318140 60910 0276150 58090 0282160 55450 0264170 53000 0245180 50720 0228190 48770 0195200 46720 0205210 44940 0178220 43310 0167230 41790 0152240 40390 0149250 39080 0131260 37870 0121270 36740 0113280 35680 0106290 34710 0097300 33780 0093 基于片断的药物设计 方法的整合性 片断化合物库 约1000 2000个化合物 体外活性筛选结构生物学 复合物X 线晶体学或NMR或MS计算机分子设计辅助药物设计和化学合成活性评价结构生物学或分子对接构效分析确定先导物 片断化合物库 体外筛选评价 达到规定活性 复合物单晶结构 是 否 计算机辅助设计 药物化学合成 达到规定活性 是 否 确定先导物 片断化合物举例 片断分子 受体结合部位 片断连接 片断分子分别筛选与组合库比较 6X6片断组合库 随机筛选 基于结构的 新方法 筛选低分子量 低亲和力片段 药靶结构信息 优化或连接 与药靶亲和力高并且类药性强 FBDD需要有灵敏的检测手段 NMR方法 SkinnerAL andLaurenceJS JPharmSci 2008 97 4670X ray方法 JhotiHetal CurrOpinChemBiol 2007 11 48SPR方法 NeumannTetal CurrTopMedChem 2007 7 1630MS方法 AnnisDAetal Curr Opin Chem Biol 2007 11 51 一 磁共振技术基本原理在于配体与生物大分子结合后 许多NMR参数 如化学位移 会发生改变 通过检测并分析这些数据 可以判定配体是否与受体结合 结合的强度以及结合的模式 NMR筛选片段的方法一般可分为两种 检测配体的筛选检测受体的筛选 基态 激发态 基态 时间不同 分子大小有关 分子大 时间短分子小 时间长 延长预测时间 只检测小分子药物 检测配体的筛选 普通条件 小分子化合物的NMR 靶蛋白 延迟 再次检测 未结合靶蛋白可检测 结合靶蛋白不可检测 混合物与靶蛋白结合 有的峰消失 表示有活性 提取分离 检测受体的筛选 先决条件是必须知道靶蛋白的结构 要求靶蛋白需进行15N标记 这样才能保证靶蛋白NMR谱能准确识别每个酰胺结合位点的特征峰 原理是当小分子与靶蛋白结合后 会改变蛋白质结合位点的局部化学环境 通过15N标记蛋白的二维15N和1H异核单量子相关谱 可以找出各酰胺信号15N和1H的化学位移变化 如果片段有结合 相关氨基酸残基的酰胺信号就会发生位移 因此这种方法不仅可检测到片段是否有结合 而且还能检测结合在靶蛋白的哪个位置 通过二维15N异核单量子相关谱中15N和1H的化学位移的变化来检测是否有小分子与靶蛋白结合 配体与靶蛋白的结合常数可以通过化学位移的变化和配体浓度的关系测得 这样可以筛选得到结合于生物靶分子活性位点亚区域的低亲和配体 将这些配体进行连接可以得到具有较高亲和力的配体 然后通过对作用于每个亚区域的片段进行优化和重新组装便得到所期望的高亲和性配体 二 质谱技术 非共价结合1 电喷雾电离质谱方法 将所筛选的片段与靶蛋白配成混合液 然后设定合适的离子化条件 将片段 靶蛋白复合物从液相转化为气相 并测定复合物的质荷比 这样可以得到结合片段的分子量 进而确定是哪一个片段与药靶结合 之后 用各种色谱技术分离得到片段 靶蛋白复合物 并将片段从复合物上解离下来 通过浓度测定 计算得到片段的亲和力 2 Tether方法 共价结合靶蛋白的半胱氨酸残基巯基与连有二硫键侧链的片段形成新的二硫键 一般来说 应用Tether方法筛选的含有二硫键片段有三个部分组成 片段母体 连接基团和离去基团 其次 将片段库中的片段 各个片段分子量不同 都连上相同的巯基侧链 然后将靶蛋白置入片段的高浓度溶液中 当活性片段和靶蛋白结合时 片段和靶蛋白间不仅能够形成共价的二硫键 而且片段还会与半胱氨酸残基附近的活性口袋结合 从而形成比其他片段更稳定的片段 靶蛋白共价复合物 占主导地位 这样根据复合物的分子量就可以在质谱图上轻易地识别活性片段 而且根据插入的半胱氨酸残基位置的不同 还可以判断活性片段的结合位置 三 X 射线单晶衍射技术 片断演化成先导物的三种模式 片断的生长 片断只结合于受体的部分结合位点 以受体结合的第一个片断为核心 经理性设计 在邻近处逐渐生长成活性强的较大分子 片断的连接 与受体结合的相邻的两个片断经连接基连接成活性强的较大分子 片断的融合 与受体结合的相互交盖或甚近的两个片断合并成活性强的较大分子 片断生长 蛋白激酶B PKB 抑制剂先导物 优化结构要求化合物的配体效率保持在0 30以上 基于PKB与苗头物的三维结合特征 发现在苯环对位的结合部位有负性基团和较大的腔穴 合成了含有碱性基团的化合物 活性提高 虽分子量增大 仍保持了LE值 加入新的苯环 仍维持了相同的配体效率 最后在新的苯环上引入卤素 得到高活性 IC50 M 80123 00 510 200 0310 018NoHA10151520232124LE kcal mol 0 470 480 610 430 400 490 44FQ0 700 831 050 920 961 091 09 片断生长 周期蛋白依赖的激酶抑制剂 周期蛋白依赖的激酶 CDK 活性取决于周期蛋白的存在 其表达水平与细胞周期相关 抑制CDK可抑制肿瘤生长 两个氢键和芳环疏水作用 MW 316IC50 0 66 MLE 0 38LQ 0 85 Leu81羰基形成氢键 Ile10andLeu134与苯环的疏水作用 MW 118IC50 185 MLE 0 57FQ 0 76 MW 187IC50 97 MLE 0 39FQ 0 64 另一思路是去除苯并环 活性减弱 但LE未降 MW 258IC50 0 85 MLE 0 44FQ 0 90 简化后的吡唑4位可向外生长 氢键给体有利于结合 活性明显提高 LE大增 23 33 MW 337IC50 0 14 MLE 0 39FQ 0 97 MW 373IC50 0 003 MLE 0 45FQ 1 19 苯甲酰胺的活性略增 LE降低 苯环离开羰基明面51 说明不稳定 苯环2 6位双取代稳定了构象 活性提升 但进入细胞能力弱 ClogP过大 分子内氢键所致 MW 395IC50 0 047 MLE 0 42FQ 1 06 二氯取代 对酶和细胞活性均明显增高 MW 362IC50 0 14 MLE 0 31FQ 0 79 AT7519于10 M对P4501A2 2D6 3A4 2C9 2C19的抑制作用 30 水溶性 HCl盐 25mg ml进入临床研究 苯环换成哌啶 酶活水平性降低 但对细胞作用增强 片断生长 平行合成 甲基转移酶抑制剂 Hajduk等研究红霉素耐药菌甲基转移酶抑制剂 用NMR方法筛选片断分子 发现氨基均三嗪的Ki 1mM 均三嗪骨架适于平行合成 将甲硫基替换成各种胺基 得到先导化合物 Ki 8 M 片断生长 极光激酶抑制剂 极光激酶 Aurorakinase 调节细胞有丝分裂起关键作用 是抗癌药物的靶标 用蛋白浸泡技术发现吡唑基苯并咪唑可结合极光激酶A X 线晶体学研究表明 该化合物结合于在激酶深部的ATP结合位点 进而发现苯甲酰氨基化合物活性增强 因为占据了一个疏水腔 为了同时提高对于AuroraB的抑制作用 在苯并咪唑的5位引入吗啉环 提高了对AuroraA和B的抑制活性 该化合物的小鼠药代动力学性质为 Cl 43 mL min kg F 26 而血浆蛋白结合率过高 99 5 为了全面优化药效和药代性质 分析该化合物的晶体结构 发现氟代苯基并未完全适配于结合腔内 在不增加分子量和ClogP的原则下 保持分子骨架和药效团不变 将苯甲酰胺基变换成环丙脲基AT9283 药效和药代性质均明显优化 IC50 M 0 0910 0700 0100 003LE0 500 490 350 42FQ1 091 181 071 17 尿激酶型纤维蛋白溶酶原活化抑制剂 尿激酶型纤维蛋白酶原激活剂 uPA 与其受体 uPAR 结合 可催化裂解纤维蛋白酶原的Arg Val酰氨键生成纤维蛋白酶 后者负责许多蛋白的水解过程 降解胞内基质的多种成份 引发细胞的迁移 所以 uPA介导了许多病理过程如主动脉瘤 多发性硬化症和癌转移等 抑制uPA的作用可望治疗这些疾病 筛选小分子弱碱性药物美西律 mexiletine 对uPA的抑制作用IC50 1mM 且只有R构型与酶结合 晶体衍射表明 伯氨基与Asp189的羧基 Ser190的羰基以及Gly219形成氢键 苯基与亚乙基与S1疏水强结合 美西律虽配体效率只有0 32 但水溶性很好 且口服生物利用度F 90 pKa 9 2 碱性不象既有的uPA抑制剂过强 故是良好的起始物 根据萘脒具有活性说明苯环的对位有空间 可引入酸性基团 去掉侧链甲基以消除手性原子 将2 6 二甲基换成二氯 IC50 40 M 在晶体结构的引导下 酰苯胺的IC50 5 2 M IC50 720nM 最后经SAR设计化合物活性提高10倍 IC50 72nM 对大鼠具有良好药代动力学性质 半衰期t1 2 7 5h F 60 IC50 1mM40 M5 2 M720nMLE0 320 400 290 29FQ0 570 760 740 84 IC50 72nMLE 0 32FQ 0 97 片断连接 FKBP抑制剂 用核磁共振研究FKBP抑制剂 称作SARbyNMR 用15N标记的FKBP筛选片断库的结合作用 观察和确定酰胺键的15N 和1H化学位移的变化 筛选两种分子1和2有弱结合作用 连接成3为强抑制剂 123Kd2 M100 M49nM非氢原子数261745LE kcal mol 0 300 320 22FQ0 790 641 06 片断连接 他克林形成挛药 胆碱酯酶有两个结合位点 深部窄口处的催化部位和暴露于水相的外部位点 将适宜长度的碳链连接他克林 提高了活性 Ki 0 018 M 小鼠 IC50 0 59 M 大鼠脑 HANo 15LE 0 57FQ 0 98 IC50 0 0004 M 大鼠脑 HANo 37LE 0 35FQ 1 25 片断连接 他克林与另一弱作用片断形成强抑制剂 Sharpless等用环加成反应将两个不同的抑制剂片断经连接基生成fmole级的高活性胆碱酯酶抑制剂 Ki 1 1 M 小鼠 HANo 31LE 0 26FQ 0 80 Ki 0 018 M 小鼠 HANo 15LE 0 57FQ 0 98 Ki 0 00000041 M 小鼠 HANo 48LE 0 35FQ 1 80 片断融合 自组装碳酸酐酶抑制剂 两个片断独立结合于邻近的两个位点 化学活性功能基自组装成亚胺 还原生成高活性抑制剂 片断融合 用质谱方法研究U1061ARNA抑制剂 U1061ARNA是抗微生物感染的靶标 质谱法可在高浓度下进行 可给出结合信息 化学计量性 竞争结合性 化合物1和2可同时结合于靶标 二者非竞争性结合 位点不同 相距邻近 1和2融合一起 提高了活性 IC5040 M41 M0 064 MNoHA121931LE0 320 500 31FQ0 481 020 97 分子量 分布系数 药代过膜性生物利用度 药代半衰期代谢稳定性 药效配体效率 药效配体亲脂效率 分子体积 杂原子数 分子表面积 氢键接受体 氢键给体 可旋转性键 极性表面积 分子量和分布系数是优化物化性质 药效学 药代动力学的高度概括 药物代谢通常分为两相 第 相 phase 代谢 第 相 phase 代谢 一 代谢 第 相主要是官能团化反应 药物在酶的催化下进行氧化 还原 水解和羟化等过程 在药物分子中引入或使药物分子暴露出极性基团 如 OH SH COOH和 NH2等 第 相为结合反应 相代谢产物或原型药物在酶的影响下与内源性小分子成分 如葡萄糖醛酸 硫酸 甘氨酸或谷胱甘肽 经共价键结合 生成极性强或水溶性的药理失活结合物 随尿和胆汁排出体外 1 1芳环的氧化含芳环药物的氧化代谢是以生成酚的代谢产物为主 羟基化反应主要发生在芳环的对位 苯妥英 1 2烯烃的氧化 由于烯烃化合物比芳香烃的 键活性高 因此烯烃化合物也会被代谢生成环氧化合物中间体 比前面的稳定 例如抗癫痫药物卡马西平只有通过代谢转化为环氧化物中间体后才具有抗惊厥活性 1 3胺的氧化含氮药物的氧化代谢主要发生在两个部位 一是在和氮原子相连接的碳原子上 发生N 脱烷基化和脱氨反应 另一是发生N 氧化反应 含伯胺基的化合物容易进行脱氨基反应 如苯丙胺易发生氧化脱氨 若伯氨基直接与叔碳原子相连 则不能发生脱氨基反应 因为不能进行氨基 C的羟基化中间过程 如全身麻醉剂氯胺酮进行N 脱甲基反应后得到的代谢物不能再进行脱氨反应 NH3 苯丙胺 氯胺酮 对于叔胺和仲胺化合物 叔胺的脱烷基化反应速度比仲胺快 利多卡因 1 4醚及硫醚的氧化含氧化物的氧化代谢以醚类药物为主 醚类药物在微粒体混合功能酶的催化下 进行O 脱烷基化反应 1 5醇和醛的氧化 醇羟基的药物在体内醇脱氢酶的催化下 脱氢氧化得到相应的羰基化合物 大部分伯醇在体内很容易被氧化生成醛 但醛不稳定 在体内醛脱氢酶等酶的催化下进一步氧化生成羧酸 仲醇中的一部分可被氧化生成酮 也有不少仲醇不经氧化而和叔醇一样经结合反应直接排出体外 2 还原反应 2 1羰基的还原酮羰基是药物结构中常见的基团 通常在体内经酮还原酶的作用 生成仲醇 脂肪族和芳香族不对称酮羰基在酶的催化下 立体专一性还原生成一个手性羟基 主要是S 构型 即使有其他手性中心存在亦是如此 2 2硝基和偶氮化合物的还原 芳香族硝基在代谢还原过程中 在CYP450酶系消化道细菌硝基还原酶等酶的催化下 还原生成芳香氨基 偶氮基的还原在很多方面和硝基还原相似 该反应也是在CYP450酶系 NADPH CYP450还原酶及消化道某些细菌的还原酶的催化下进行的 氧的存在通常也会抑制还原反应的进行 还原中 偶氮键先还原生成氢化偶氮键 最后断裂形成两个氨基 3 水解反应 hydrolysis 水解反应是具有酯和酰胺类药物在体内代谢的主要途径 如羧酸酯 硝酸酯 磺酸酯 酰胺等药物在体内代谢生成相应的酸及醇或胺 4 结合反应是在酶的催化下将内源性的亲水反应物如葡萄糖醛酸 硫酸 氨基酸 谷胱甘肽等结合到原药物或第 相的药物代谢产物中 通过结合使药物去活化以及产生水溶性的代谢物 有利于从尿和胆汁中排泄 实际上绝大多数药物的代谢都比较复杂 其引用药物的生物效应变化多样 综合有以下几种 1 代谢灭活 将活性药物代谢为无活性的物质 2 代谢活化 将无活性的药物代谢为有活性的物质 3 活性不变 将活性物质代谢为仍有活性的物质 4 毒性增加 将无毒性或毒性小的药物代谢为毒性物质 5 导致药理作用改变 二 先导化合物的优化 一 先导化合物的一般优化方法1 剖裂与拼合剖裂是指将先导化合物剖析成两个或数个亚结构 通过合成或构效关系可以优选出简化的基本结构或药物 吗啡到哌替啶 推断Prontosil在体内代谢为sulfanilamide 而产生抗菌