实验五-大蒜SOD制备.doc

实验五制备大蒜SOD实验申请实验题目：实验原理: 利用丙酮沉淀法，从大蒜汁中分离提取SOD实验原料：新鲜蒜瓣约20g实验仪器：离心机超声波细胞破碎分光光度计辅助仪器：电子天平、圆底烧瓶、烧杯、玻璃棒、真空泵、分液漏斗、研钵等实验试剂：50mM NaPi buffer ( pH7.8) (91.5+8.5)缓冲液、氯仿、乙醇、预冷丙酮、活性测定缓冲液参考书目：1 李永利,张众.邻苯三酚自氧化法测定活性 J.中国卫生检验2000,12,10(6):6732 孙永君. 大蒜中SOD 的提取研究J.化学与生物工程.2005,(10):23253 邹芝芳,刘佳佳.三种大蒜中提取SOD 的对比研究J.食品科学2004,34(5)4 张丽,罗丽萍,谷力.大蒜SOD 的分离纯化及其低温胁迫下的酶活性J.吉首大学学qtw-1报 .2003,24(4)实验记录操作记录：制备大蒜SOD 操作说明及结果记录：校正天平后，取新鲜蒜瓣 20g可以数组合并进行。组织捣碎机处理10min。合并破碎者，需要先分开，再进行相关操作。加入50mM NaPi buffer ( pH7.8) (91.5+8.5)150ml 磷酸缓冲液，搅拌均匀。超声破碎(5s+10s)40 times (冰水浴)搅拌浸提10min先用纱布过滤，再用漏斗过滤，得滤液60 热变性20min过滤或离心去除沉淀，得上清液，测体积V1。另取适量体积的(20ml)滤液，加2 倍体积的氯仿-乙醇(3：5)，于分液漏斗中振荡5min。分离上层水相，加入等体积的预冷丙酮。搅拌15 分钟，使沉淀完全。4000rpm,15min 离心，收集沉淀注意先称离心管质量将沉淀称重，得产品，计算收率。部分沉淀用活性测定缓冲液溶解，用于SOD 活性检测，计算总的酶活与得率。qtw-2实验结果与分析数据整理：1、 空离心管质量：第组 4.131g第组 4.056g粗体物与容器质量：第组 4.265g第组 4.223g产品质量：第组 4.265-4.131=0.134g第组 4.223-4.056=0.167g2、 冰丙酮沉淀SODqtw-3冰丙酮加入溶液中后出现大量白色絮状沉淀，在10000rpm下高速离心出现淡黄色沉淀。3、 邻苯三酚自氧化抑制标准曲线制作邻苯三酚自氧化速率测定表1：试剂测量管空白管Tris-HCl PH8.0 100mmol/L4.5 4.5 ddH2O2.2 2.5 PH8.7磷酸缓冲溶液2.0 2.0 邻苯三酚3mmol/L(用10mmol/L HCl配制)0.3 0.0 酶活力测定表2：试剂测量管空白管Tris-HCl PH8.0 100mmol/L4.5 4.5 ddH2O2.2 2.5 酶溶液2.0 0.0 PH8.7磷酸缓冲溶液0.0 2.0 邻苯三酚3mmol/L(用10mmol/L HCl配制)0.3 0.0 吸光度测定数据： 浸提温度条件：室温时间吸光度邻苯三酚自氧化酶活抑制邻苯三酚自氧化0.0 0.066 0.069 0.5 0.084 0.081 1.0 0.098 0.092 1.5 0.105 0.100 2.0 0.115 0.111 2.5 0.122 0.119 3.0 0.128 0.128 3.5 0.135 0.134 4.0 0.142 0.140 4.5 0.144 0.149 5.0 0.149 0.152 qtw-4由于0-3s之间的吸光值与时间基本符合线性关系，所以去0-3s间数据做曲线得：邻苯三酚自氧化标准曲线方程： R2=0.9627酶活抑制邻苯三酚自氧化方程： R2=0.9963邻苯三酚自氧化速率A0=0.0199加入SOD后邻苯三酚自氧化速率A=0.0194 数据分析：从标准曲线上可以看出加入SOD的吸光度直线斜率略小于未计入酶溶液之前，说明SOD对邻苯三酚自氧化现象有抑制作用。但从实验结果分析，抑制作用不明显，直线斜率改变不大。也反映出分离提取的SOD纯度不高，提取效率较低，分析有以下几点原因：qtw-51、 在浸提步骤中，前两组采用60水浴浸提，浸提效率较高，抑制效果较为明显；本组实验采用室温条件下浸提，浸提时间较短，浸提不够充分，提取效率较低，抑制效果不明显，与前两组形成明显差异。也说明60下水浴浸提为更为优化的SOD提取工艺。2、 邻苯三酚自氧化试剂的自氧化速率较快，不易保存。所以实验所用的该试剂应现用现配，以保证试剂纯度。二本实验中的邻苯三酚试剂配制时间较长，部分试剂已完成自氧化过程，试剂纯度低，活性差，对实验结果造成一些影响。3、 本实验操作中采用超声波破碎技术，但是试验中超声波破碎仪的破碎效果不明显，对实验结果造成一些影响。操作总结：1、无论是手动搅拌还是机械搅拌，注意搅拌速度的控制。搅拌过快，过于剧烈，会使部分蛋白变性，影响SOD 的得率值。2、SOD 是一种热稳定性很好的酶。当温度低于80时，短时间的热处理酶活力不会有明显的变化，而一般杂蛋白却在高于55时就易变性沉淀，因此对大蒜抽提液进行短时间的热处理以达到去除杂蛋白的目的。3、邻苯三酚试剂要在最后加入，并立即进行比色。若耽搁时间过长，试剂显色程度会发生变化，表现在吸光值上就是测定不准。4、用丙酮沉淀法可以很方便地从大蒜汁中分离制得粗品SOD,能把大部分杂蛋白如粘多糖去除,但这种方法的缺陷就是要使用大量的有机溶媒,难以规模化制备。原理总结：1、概述qtw-6超氧化物歧化酶（SOD）是一种具有抗氧化、抗衰老、抗辐射和消炎作用的药用酶。它可催化超氧负离子（O 2-）进行歧化反应，生成氧和过氧化氢。大蒜蒜瓣和悬浮培养的大蒜细胞中含有较丰富的SOD，通过组织或细胞破碎后，可用pH7.8磷酸缓冲液提取出。由于SOD不溶于丙酮，可用丙酮将其沉淀析出。植物叶片在衰老过程中发生一系列生理生化变化，如核酸和蛋白质含量下降、叶绿素降解、光合作用降低及内源激素平衡失调等。这些指标在一定程度上反映衰老过程的变化。近来大量研究表明，植物在逆境胁迫或衰老过程中，细胞内自由基代谢平衡被破坏而有利于自由基的产生。过剩自由基的毒害之一是引发或加剧膜脂过氧化作用，造成细胞膜系统的损伤，严重时会导致植物细胞死亡。邻苯三酚在碱性条件下可迅速自氧化,释放出O2-,生成带色的中间产物,在325nm有最大吸收峰。邻苯三酚自氧化产生的中间产物在40s-3min 这段时间，生成物与时间有较好的线性关系。颜色深SOD 逐渐增多颜色浅，即酶活力越大，颜色越浅。2、SOD催化反应机理SOD的耐热性较强，在65 以下温度对酶活影响很小，但温度一旦高于70 ，酶活力则下降很快。提取植物SOD的最适宜温度为5565 ，最适宜的热变性时间为15 min。大部分蛋白质的变性温度为55 ，可以利用SOD和杂蛋白变性温度的差异进行热变性实现初SOD 是一种广泛存在于生物体内,能催化超氧负离子发生歧化反应的金属酶类。由于该酶能有效清除机体内超氧自由基,从而有效地预防活性氧对生物品的毒害作用,因而具有抗辐射、抗肿瘤及延缓机体衰老等功能,在保健品、医药和化妆品行业中有重要的应用价值。研究表明,外源SOD 具有保护DNA、蛋白质和细胞膜的作用,使其免遭超氧负离子的破坏,对辐射有防护作用。步分离，且不引入杂质。SOD是含金属辅基的酶。高等植物含有两种类型的SOD：MnSOD和Cu.ZnSOD，它们可催化下列反应：qtw-7大蒜SOD 的价值大蒜所含化学成分十分复杂,含有挥发油、多种氨基酸、维生素、糖及丰富的蛋白质,并含有多种矿物质及微量元素。研究证明大蒜具有卓越的抗菌、抗病毒、抗肿瘤、降血脂、提高机体免疫功能、降血糖、解毒等功效。近年来将大蒜用于农、林、牧、渔方面防治病虫害和提高产量的研究也有很大进展。大蒜被美国时代专刊推荐为现代人十大最健康的食品之一。我国是世界大蒜种植的第一大国,产量和出口量均居世界前列。因此研究开发利用大蒜资源具有重要意义。目前我国传统工业大多从动物的血液和内脏器官中提取SOD，但这类原料来源有限，成分复杂，且在储存、运输等方面存在诸多不便，因此容易导致生产工艺复杂化，使生产成本大幅度上升。近来的研究发现，大蒜细胞中含有丰富的Cu、Zn-SOD，其分子量约为32000，与从牛血等动物血红蛋白中所提取的SOD 十分接近，,用大蒜提取可使生产成本显著降低,而且生产工艺也能得到很大简化,这对于扩大生产规模、实现SOD 的广泛应用十分有利，而且其它各项性能也来源丰富、易于处理而使生产成本大大降低，而且生产工艺也能得到很大的简化，这对于扩大生产规模，实现SOD 的广泛应用将是十分有益的。实验问题：1、为什么要从植物中提取SOD？初步验证阶段。国外SOD主要应用于医疗、保健方面，有以动物血液及内脏为原料制取SOD的报导，但存在着成本高、含有致热因子等缺陷，因此，适用范围极为有限。尤其是近年来受“疯牛病”的影响，许多国家和地区抵制以动物血液及内脏为原料制取的超氧化物歧化酶，使得超氧化物歧化酶在国际市场上极为紧缺。qtw-8从植物，特别是人们日常经常食用的蔬菜、瓜果、野生植物及粮食中提取SOD，使用安全性非常高，避免了可能发生的交叉感染。利用全新的生物技术从植物中提取SOD，具有明显的社会和经济效益，市场前景广阔。从植物中提取SOD的主要工艺流程为:植物打浆超滤分离有机溶剂去杂柱层析精制超滤浓缩冷冻干燥产品2、用Tric-HCl而不用磷酸缓冲液的原因因为反应物连苯三酚在酸性条件下稳定，在碱性条件下能自氧化。而SOD活力的测定是依靠SOD抑制连苯三酚的自氧化实现的。磷酸缓冲液pH大约为7点多，无法提供连苯三酚自氧化需要的碱性环境。3、邻苯三酚加入量对测量的影响邻苯三酚的浓度是决定其自氧化速率高低的一个主要因素，浓度越高，自氧化速度越快，相同单位的SOD对邻苯三酚自氧化的抑制程度就越小，从而使得测量结果越低。所以为使结果具有可重复性，必须严格控制测定液中邻苯三酚的终浓度保持相同。qtw-9实验补充材料一、（一般）酶的分离纯化方法：提取原则a. 相似相溶。酶提取时首先应根据酶的结构和溶解性质，选择适当的溶剂。一般说来，极性物质易溶于极性溶剂中，非极性物质易溶于非极性的有机溶剂中，酸性物质易溶于碱性溶剂中，碱性物质易溶于酸性溶剂中。酶都能溶解于水，通常可用水或稀酸、稀碱、稀盐溶液等进行提取，有些酶与脂质结合或含有较多的非极性基团，则可用有机溶剂提取。 b. 远离等电点的pH值，溶解度增加。酶的提取方法提取方法使用的溶剂或溶液提取对象盐溶液提取0.020.5mol/L的盐溶液用于提取在低浓度盐溶液中溶解度较大的酶酸溶液提取PH26的水溶液用于提取在稀酸溶液中溶解度大，且稳定性较好的酶碱溶液提取PH812的水溶液用于提取在稀碱溶液中溶解度大且稳定性较好的酶有机溶剂提取可与水混溶的有机溶剂用于提取那些与脂质结合牢固或含有较多非极性基团的酶1沉淀分离 沉淀分离是通过改变某些条件或添加某种物质，使酶的溶解度降低，而从溶液中沉淀析出，与其它溶质分离的技术过程。沉淀分离方法分离原理 盐析沉淀法利用不同蛋白质在不同的盐浓度条件下溶解度不同的特性，通过在酶液中添加一定浓度的中性盐使酶或杂质从溶液中析出沉淀从而使酶与杂质分离等电点沉淀法利用两性电解质在等电点时溶解度最低以及不同的两性电解质有不同的等电点这一特性，通过调节溶液的pH值，使酶或杂质沉淀析出从而使酶与杂质分离有机溶剂沉淀法利用酶与其它杂质在有机溶剂中的溶解度不同，通过添加一定量的某种有机溶剂，使酶或杂质沉淀析出，从而使酶与杂质分离选择性变性沉淀法选择一定的条件使酶液中存在的某些杂质变性沉淀，而不影响所需的酶，从而使酶与杂质分离在蛋白质的盐析中，通常采用的中性盐有硫酸铵、硫酸钠、硫酸钾、硫酸镁、氯化钠和磷酸钠等。其中以硫酸铵最为常用。在盐浓度达到某一界限后，酶的溶解度随盐浓度升高而降低，这称为盐析现象。 qtw-10有机溶剂之所以能使酶沉淀析出。主要是由于有机溶剂的存在会使溶液的介电常数降低。溶液的介电常数降低，就使溶质分子间的静电引力增大，互相吸引而易于凝集，同时，对于具有水膜的分子来说，有机溶剂与水互相作用，使溶质分子表面的水膜破坏，也使其溶解度降低而沉淀析出。 常用于酶的沉淀分离的有机溶剂有乙醇、丙酮、异丙醇、甲醇等2离心分离 离心分离是借助于离心机旋转所产生的离心力，使不同大小、不同密度的物质分离的技术过程。在离心分离时，要根据欲分离物质以及杂质的颗粒大小、密度和特性的不同，选择适当的离心机、离心方法和离心条件。蛋白质分子在离心時，其 分子量、分子密度、组成、形状 等，均会影响其沉降速率，沉降係系数 即用來描述此沉降性质； 其单位为 S (Svedberg unit)。每一种的沉降系数与其分子密度或分子量成正比。 不同沉降系数的蛋白质，可利用超高速离心法，在密度梯度中作分離。3、过滤与膜分离过滤是借助于过滤介质将不同大小、不同形状的物质分离的技术过程。过滤的分类及其特性(根据过滤介质截留的物质颗粒大小不同 ) 类别截留颗粒大小截留的主要物质过滤介质粗滤 2m酵母、霉菌、动物细胞、植物细胞、固形物等滤纸、滤布、纤维多孔陶瓷、烧结金属等微滤0.22m细菌、灰尘等微滤膜、微孔陶瓷超滤200.2m病毒、生物大分子等超滤膜反渗透 20生物小分子、盐、离子反渗透膜借助于一定孔径的高分子薄膜，将不同大小、不同形状和不同特性的物质颗粒或分子进行分离的技术称为膜分离技术。膜分离所使用的薄膜主要是由丙烯腈、醋酸纤维素、赛璐玢以及尼龙等高分子聚合物制成的高分子膜。有时也可以采用动物膜等。膜分离过程中，薄膜的作用是选择性地让小于其孔径的物质颗粒或分子通过，而把大于其孔径的颗粒截留。膜的孔径有多种规格可供使用时选择。微滤，推动力是压力差，分离机理为筛分超滤，同上纳滤，同上，分离机理为优先吸附和表面电位反渗透，同上，分离机理为优先吸附和溶解扩散4层析技术，亦称色谱技术，是一种物理的分离方法。利用混合物中各组分物理化学性质的差异（如吸附力、分子形状及大小、分子亲和力、分配系数等），使各组分在流动相和固定相中的分布程度不同，并以不同的速度移动而达到分离的目的。层析法的分类:l 流动相有两种状态： 液体作为流动相 气体作为流动相qtw-11l 固定相也有两种状态： 固体吸附剂作为固定相 以吸附在固体上的液体作为固定相l 按两相所处的状态分类： 液相层析 液-固层析 液-液层析l 气相层析: 气-固层析 气-液层析l 按层析过程的机理分类：吸附层析：利用吸附剂表面对不同组分吸附性能的差异。分配层析：利用不同组分在流动相和固定相之间的分配系数的不同。离子交换层析：利用不同组分对离子交换剂亲和力的不同。凝胶层析：利用某些凝胶对于不同分子大小的组分阻滞作用的不同。l 按操作形式不同分类：柱层析：将固定相装于柱内，使样品沿一个方向移动而达到分离。纸层析：用滤纸做液体的载体，点样后，用流动相展开，以达到分离鉴定的目的。薄层层析：将适当粒度的吸附剂铺成薄层，以纸层析类似的方法进行物质的分离和鉴定层析分离方法层析方法分离依据吸附层析利用吸附剂对不同物质的吸附力不同而使混合物中各组分分离分配层析利用各组分在两相中的分配系数不同，而使各组分分离离子交换层析利用离子交换剂上的可解离基团（活性基团）对各种离子的亲和力不同而达到分离目的凝胶层析以各种多孔凝胶为固定相，利用流动相中所含各种组分的相对分子质量不同而达到物质分离亲和层析利用生物分子与配基之间所具有的专一而又可逆的亲和力，使生物分子分离纯化层析聚焦将酶等两性物质的等电点特性与离子交换层析的特性结合在一起，实现组分分离5、电泳分离带电粒子在电场中向着与其本身所带电荷相反的电极移动的过程称为电泳。电泳方法按其使用的支持体的不同，可以分为： 纸电泳 薄层电泳 薄膜电泳 凝胶电泳 自由电泳等电聚焦电泳 颗粒在电场中的移动速度主要决定于其本身所带的净电荷量，同时受颗粒形状和颗粒大小的影响。此外，还受到电场强度、溶液pH值、离子强度及支持体的特性等外界条件的影响。 6、萃取分离qtw-12萃取分离是利用物质在两相中的溶解度不同而使其分离的技术。萃取分离中的两相一般为互不相溶的两个液相。有时也可采用其它流体。按照两相的组成不同，萃取可以分为：有机溶剂萃取 双水相萃取 超临界萃取 反胶束萃取 各种双水相系统：聚合物P 聚合物Q或盐聚丙二醇甲基聚丙二醇，聚乙二醇，聚乙烯醇，聚乙烯吡咯烷酮，羟丙基葡聚糖，葡聚糖聚乙二醇聚乙烯醇，葡聚糖，聚蔗糖甲基纤维素羟甲基葡聚糖，葡聚糖乙基羟乙基纤维素葡聚糖羟丙基葡聚糖葡聚糖聚蔗糖葡聚糖聚乙二醇硫酸镁，硫酸铵，硫酸钠，甲酸钠，酒石酸钾钠二、纯化方案的设计与评价一、纯化方案的设计l （一）纯化方法的选择依据l 根据有效成分和杂质之间理化性质的差异l 调节溶解度：沉淀法2. 根据分子大小、形状的不同： 离心分离，膜分离，凝胶过滤3. 根据分子电荷性质的不同： 离子交换层析，电泳4. 根据专一性结合的方法：亲和层析5. 其它：吸附层析，疏水层析二、纯化方案的评价（一）酶活力测定： 酶活力(enzyme activity)又称酶活性，是指酶催化某一化学反应的能力。其大小可用在一定的条件下，酶催化某一化学反应的反应速率来表示。 一般用单位时间内产物生成的量来表示酶催化的反应速率 。常用的方法 ： 1. 化学分析法（比色法）：产物可与特定的化学试剂反应生成稳定的有色溶液 。 2. 分光光度法： 利用底物和产物光吸收性质的不同 。 3. 量气法： 酶促反应中产物或底物之一为气体。 4. 滴定法（pH值测量法）：产物之一是自由的酸性物质或碱性物质。多用pH电极测。 常用终止反应方法：1）改变反应最适条件： 加酸、碱、加热2）加酶变性剂： 5三氯乙酸酶活力单位： 通常采用国际酶学委员会规定的单位。但在纯化过程中，为了方便，可采用自行规定的单位，只要达到可比较的目的即可，如直接以光密度值表示。 常用比活力表示酶制剂的纯度： 酶活力（u/ml） 比活力qtw-13 蛋白质含量（mg蛋白/ml酶液）