21 常用分子生物学技术的原理及应用.ppt

第二十一章 常用分子生物学技术原理及其应用Thepopulartechnologyinmolecularbiology principleandapplication 第一节分子印迹与杂交技术 一 核酸分子印迹与杂交技术 核酸分子杂交 nucleicacidhybridization 指具有一定互补序列的不同来源的核苷酸单链在一定条件下按照碱基互补配对的原则形成双链的过程 杂交双链 heteroduplex 利用各种物理方法使电泳胶中的生物大分子转移到特定的支持物上 使之成为固相化分子 称之为印迹 blotting 印迹 blotting 一 Southern印迹杂交 Southern印迹杂交 Southernblotting DNA与DNA分子之间的杂交 基本过程 将琼脂糖凝胶电泳分离的待测DNA片段变性后 将凝胶中的DNA分子转移到一定的固相支持物上 然后用标记的探针检测待测的DNA 探针 probe 是指经过特殊标记的已知序列核苷酸片段 可以用来检测某一特定核苷酸序列或基因序列的DNA或RNA片段 探针的种类寡核苷酸基因组DNAcDNA片段RNA片段 标记物放射性同位素生物素荧光染料 Southern印迹杂交的基本步骤 待测DNA样品的限制性内切酶消化 酶切DNA样品的电泳分离 凝胶中DNA的变性和Southern转移 探针的制备 Southern杂交 杂交结果的检测 10 SSC转移缓冲液 Whatman滤纸 凝胶 Whatman滤纸 纸巾 玻璃板 重物 与探针同源杂交的基因DNA片段 基因组DNA DNA酶切片段 NC或尼龙膜 NC膜或尼龙膜 基因组DNA的定性与定量分析 如对在基因组中特异基因的定位及检测等 重组质粒和噬菌体的分析 Southertblotting用途 二 Northern印迹杂交 利用类似于Southern印迹杂交的技术来检测RNA称为Northern印迹杂交 Northernblotting Northern印迹杂交基本原理和过程与Southern印迹基本相同 只是检测的分子是RNA 可用来对组织或细胞中的mRNA进行定性或定量分析 Northern印迹杂交的基本过程 放射自显影照片 相同点 Northern与Southernblotting的异同点 转移的是RNA转移前无需酶切转移效率较高变性方法 DNA 碱变性 RNA 甲醛 乙二醛等 不同点 原理均为毛细作用 Northernblotting用途检测某一组织或细胞中已知的特异mRNA的表达水平 比较不同组织和细胞的同一基因的表达情况 三 其他核酸杂交方法 1 斑点印迹杂交 2 原位杂交 insituhybridization 二 蛋白质印迹技术 Westernblotting 根据蛋白质分子之间存在相互作用的特点 将蛋白质电泳分离 然后将其转移和固定于固体支持物 NC膜或其它膜 上 再用相应的蛋白质分子 最常用的是抗体 对其进行检测 因此 被称为免疫印迹 immunoblotting 技术 Westernblotting应用 检测样品中的特异蛋白质的存在细胞中特异蛋白质的定量分析蛋白质分子的相互作用研究 B Fig 1 1EffectsofGTEandEGCGonthedegradationofhypoxia inducedHIF 1 proteininHeLacells ResultofWesternblotting B QuantitativedensitometricanalysisofresultsfromA Westernblotting的应用 Fig 1 1WesternblotanalysisofHIF 1 proteinlevels Lane1 mocktransfectioncontrol Lane2 pSG5emptyvectorcontrol Lane3 16E6 Lane4 16E7 Lane5 16E6mutant Lane6 16E7mutant HPV 16癌蛋白增强宫颈癌细胞HIF 1 的蛋白表达 首先将混合蛋白质用SDS 聚丙烯酰胺凝胶 PAGE 电泳按分子大小分开 再将蛋白质转移到NC膜上 蛋白质的位置可保持在胶中的原位上 蛋白质印迹与DNA RNA印迹相似之处 电泳 转移 杂交 放射自显影化学显色化学发光 蛋白质的转移只有靠电转移蛋白质的检测以抗体作探针用碱性磷酸酶 ALP 辣根过氧化酶 HRP 标记第二抗体 底物显色来检测蛋白区带的信号 底物亦可与化学发光剂结合以提高敏感度 或用同位素标记第二抗体 放射自显影法检测蛋白区带的信号 蛋白质印迹与DNA RNA印迹不同之处 三种印迹技术的比较 三种印迹技术的比较 SouthernblottingNorthernblottingWesternblotting 样品 限制性内切酶酶切 电泳 变性 转移膜 紫外交联仪等固定 杂交标记物 DNA RNA 蛋白质 需要不需要不需要 琼脂糖凝胶电泳 琼脂糖凝胶电泳 SDS PAGE电泳 碱变性 甲醛或乙二醛变性 高温变性 NC膜或尼龙膜 NC膜或尼龙膜 NC膜或PVDF膜 需要需要不需要 核酸探针核酸探针抗体 第二节 PCR技术的原理与应用PolymeraseChainReaction 聚合酶链反应 TheNobelPrizeinChemistry1993 forcontributionstothedevelopmentsofmethodswithinDNA basedchemistry MichaelSmith 1944 1932 2000 LaJolla CA USA KaryB Mullis UniversityofBritishColumbiaVancouver Canada forhisinventionofthepolymerasechainreaction PCR method forhisfundamentalcontributionstotheestablishmentofoligonucleotide based site directedmutagenesisanditsdevelopmentforproteinstudies 5 Primer1 5 Primer2 5 5 TemplateDNA 一 PCR技术的基本原理 模板DNA特异性引物耐热DNA聚合酶 TaqDNA聚合酶 dNTPsMg2 PCR体系基本组成成分 PCR反应循环 变性95 C左右 延伸适温 退火Tm 5 C 经过30个左右的循环后 PCR的扩增倍数为 1 x n x 75 n为循环数 二 PCR技术的主要特点 1 特异性强 2 灵敏度高 3 简便快速 4 对标本的纯度要求低 2 利用特异性引物以cDNA或基因组DNA为模板获得已知目的基因片段 3 利用简并引物从cDNA文库或基因组文库中获得具有一定同源性的基因片段 4 利用随机引物从cDNA文库或基因组文库中随机克隆基因 1 与反转录反应相结合 直接从组织和细胞的mRNA获得目的基因片段 三 PCR技术的主要用途 一 目的基因的扩增与克隆 二 基因的体外定点突变 三 基因突变分析PCR与其他技术的结合可以大大提高基因突变检测的敏感性 四 DNA和RNA的微量分析 五 DNA序列测定 三 PCR技术的主要用途 TheNobelPrizeinChemistry1980 forhisfundamentalstudiesofthebiochemistryofnucleicacids withparticularregardtorecombinant DNA fortheircontributionsconcerningthedeterminationofbasesequencesinnucleicacids PaulBerg 1 2oftheprize StanfordUniversityStanford CA USA 1926 WalterGilbertFrederickSanger 1 4oftheprize1 4oftheprize HarvardUniversity BiologicalLaboratoriesCambridge MA USA MRCLaboratoryofMolecularBiologyCambridge UnitedKingdom 1932 1918 链末端合成终止法测定DNA序列的原理 2 3 双脱氧核苷酸 缺乏3 OH 引物 DNA聚合酶 dNTP DNA自动测序结果 反转录PCR reversetranscriptionPCR RT PCR RT PCR是目前从组织或细胞中获得目的基因以及对已知序列的RNA进行定性及半定量分析的最有效方法 一 反转录PCR技术 四 几种重要的PCR衍生技术 RT PCR技术 AAnA TTnT5 5 mRNA 反转录酶 mRNA cDNA 3 TTnT AAnA 核糖核酸酶H TTnT 3 DNApolyI cDNA 核酸酶S1 双链cDNA 3 5 3 5 5 加热变性 加入特异性引物 DNA聚合酶 PCR 扩增出大量的产物 RT PCR的结果举例 原位PCR方法弥补了PCR技术和原位杂交技术的不足 是将目的基因的扩增与定位相结合的一种最佳方法 二 原位PCR技术 insituPCR 三 实时PCR技术 实时PCR real timePCR 技术通过动态监测反应过程中的产物量 消除了产物堆积对定量分析的干扰 亦被称为定量PCR 实时PCR技术原理 TaqMan探针法 第三节基因文库GeneLibrary 基因组DNA文库 genomicDNAlibrary cDNA文库 cDNAlibrary 基因文库 genelibrary 是指一个包含了某一生物体全部DNA序列的克隆群体 一 基因组DNA文库 指包含某一生物体全部基因组DNA序列的克隆群体 储存着一个细胞或生物体的全部基因组DNA的编码区和非编码区的DNA片段 含有基因组的全部遗传信息 GenomicDNAlibrary 构建基因组DNA文库的基本过程 二 cDNA文库 cDNA文库是指某一组织在一定条件下所表达的全部mRNA经反转录而合成的全部cDNA的克隆群体 它将细胞的基因表达信息以cDNA的形式储存于的受体菌中 基因组文库和cDNA文库的比较 第四节基因修饰动物模型的建立及应用 是指将外源基因整合到动物细胞或植物细胞的基因组中并使外源基因在动物细胞或植物细胞中稳定遗传和表达的技术 基因的导入方式主要 显微注射法胚胎干细胞法逆转录病毒感染法 一 转基因技术 转基因技术基本原理是采用基因转移技术使目的基因整合入受精卵的细胞核内或着床前的胚胎干细胞 然后将细胞导入受体动物子宫 使之发育成个体 转基因 被导入的目的基因转基因动物 transgenicanimal 目的基因的受体动物 即体细胞克隆技术 是用显微操作 电融合等方法将动物体细胞的细胞核全部导入另一个个体的去除细胞核的卵细胞内 使之发育成为个体 二 核转移技术 核转移技术可使一个细胞变成一个个体 这样产生的个体所携带的遗传物质与细胞核供体的遗传物质完全一样 是一种无性繁殖的过程 即克隆 clone 通过分子生物学的方法定向地敲除动物体细胞内的某个基因的技术称为基因剔除 geneknock out 或基因打靶 genetargeting 三 基因剔除技术 定义 原理 通过DNA定点同源重组 使小鼠胚胎干细胞 ES细胞 特定的内源基因被破坏而造成其功能丧失 四 基因转移和基因剔除在医学中的应用 一 建立疾病动物模型 二 生物制药 三 治疗性克隆和生产可用于人体器官移植的动物器官 第五节生物芯片技术 DNA芯片 DNAchip DNA阵列 DNAarray cDNA芯片 cDNAchip 指将许多特定的DNA片段或cDNA片段作为探针 有规律地紧密排列固定于单位面积的支持物上 一 基因芯片 genechip 将高度密集排列的蛋白分子作为探针点阵固定在固相支持物上 当与待测蛋白样品反应时 可捕获样品中的靶蛋白 再经检测系统对靶蛋白进行定性和定量分析的一种技术 二 蛋白质芯片 proteinchip 又称蛋白质阵列 proteinarray 基本原理 蛋白质与蛋白质分子之间在空间构象上能特异性的相互识别和相互结合 最常用的探针 抗体检测方法 标记检测法 直接检测法 二 蛋白质芯片 proteinchip 蛋白质芯片结果举例 第六节蛋白质相互作用研究技术 一 酵母双杂交系统 二 噬菌体展示技术 三 蛋白质工程中的定点诱变技术 该系统的建立是基于对酵母转录因子GAL4分子的研究 GAL4 DNA结构域 BD DNAbindingdomain 转录激活域 AD activationdomain 一 酵母双杂交系统 yeasttwo hybridsystem 一