农学院植物生理学手册.doc

此文档收集于网络，如有侵权，请联系网站删除天马行空官方博客：/tmxk_docin ；QQ:1318241189；QQ群：175569632植物生理学实验指导莱阳农学院生命科学学院植物生理学教研室2005年8月21日前 言植物生理学是研究植物生命活动规律和机理的一门实验科学。它的一切结论都是通过严格的科学实验得出的。近年来现代生物技术的发展日新月异，新的实验技术、方法和仪器设备层出不穷，我校的实验装备水平也有明显改善。因此，原用实验教材中的不少内容异显得陈旧，为了适应课程建设的要求我们编了这本实验指导。本实验指导由莱阳农学院生命科学学院植物生理学教研室的刘新、车永梅、杨德翠、柏素花、战淑敏、马晓柯、刘洪庆和赵方贵负责编写完成。莱阳农学院研究生处的郑国生对全书进行了审读、修改和补充。全部编写人员均具有多年从事植物生理学教学和研究的实践经验，曾经多次编写此类教材，在使用中反应良好。鉴于编者的水平有限，编写时间较仓促，本指导难免有不足之处，敬请读者和专家指正。 编者 2005 年 8月目 录1. 实验基本常识.31.1 几种常用实验仪器操作方法介绍31.2 实验材料的采取、处理与保存91.3 实验数据的处理.122. 水分生理.142.1 气孔运动及其影响因素.142.2 露点法测定植物叶片水势和渗透势.162.3 液体交换法测定植物组织水势（小液流法、折射仪法、电导法）.183. 矿质营养.203.1 植物溶液培养和缺素培养.203.2 植物伤流液的成分分析.223.3 根系活力的测定(TTC法).243.4 硝酸还原酶(NR)活性的测定.254. 光合作用和呼吸作用.264.1 叶绿体色素的提取、分离、理化性质和定量测定.264.2 红外线CO2气体分析仪法测定植物光合与呼吸速率.304.3 抗坏血酸氧化物酶和多酚氧化酶活性的测定.394.4 水溶性碳水化合物的测定.415. 植物激素.445.1 植物组织培养技术.455.2 酶联免疫法（ELISA）测定植物激素含量.506. 植物生长发育.546.1 种子萌发和活力测定546.2 花粉活力测定567. 逆境生理.587.1 电导法测定植物细胞透性.587.2 植物组织中超氧物歧化酶活性的测定.597.3 植物体内游离脯氨酸含量的测定.607.4 植物组织中丙二醛含量的测定.627.5 植物体内氧自由基的测定和清除.638. 综合性实验.641. 实验基本常识1.1 几种常用实验仪器操作方法介绍一、WAY-1/2S阿贝折射仪测定原理数字阿贝折射仪测定透明或半透明物质的折射率原理是基于测定临界角，由目视望远镜部件和色散校正部件组成的观察部件来瞄准明暗两部分的分界线，即瞄准临界角的位置，并由角度二数字转换部件将角度量转换成数字量，输入微机系统进行数据处理，而后数字显示出被测样品的折射率或锤度。仪器结构103291113910451.11211. 目镜 2. 色散校正手轮 3. 显示窗 4. POWER电源开关 5. READ读数显示键 6. BX-TC经温度修正锤度显示键 7. nD折射率显示键 8. BX未经温度修正锤度显示键 9. 调节手轮 10. 聚光照明部件 11.折射棱镜部件 12. TEMP温度显示键 13. RS232接口(有RS232系指WYA-2S，下同)11. 折射棱镜部件9 调解手轮操作步骤及使用方法1. 按下POWER波形电源开关(4)，聚光照明部件(10)中照明灯亮，同时显示窗(3)显示00000。有时显示窗先显示-，数秒后显示00000。2. 打开折射棱镜部件(11)，移去擦镜纸，这张擦镜纸(单层)是仪器不使用时放在两棱镜之间，防止在关上棱镜时，可能留在棱镜上细小硬粒弄坏棱镜工作表面。3. 检查上、下棱镜表面，并用水或酒精小心清洁其表面。测定每一个样品后也要仔细清洁两块棱镜表面，因为留在棱镜上少量的原来样品将影响下一个样品的测量准确度。4. 将被测样品放在下面的折射棱镜的工作表面上。如样品为液体，可用干净滴管吸1-2滴液体样品放在棱镜工作表面上，然后将上面的进光棱镜盖上。如样品为固体，则固体样品必须有一个经过抛光加工的平整表面。测量前需将这抛光表面擦净，并在下面的折射棱镜工作表面上滴1-2滴折射率比固体样品折射率高的透明的液体，然后将固体样品抛光面放在折射棱镜工作表面上，使其接触良好(测固体样品时不需将上面的进光棱镜盖上)。5. 旋转聚光照明部件的转臂和聚光镜筒使上面的进光棱镜的进光表面(测液体样品)或固体样品前面的进光表面(测固体样品)得到均匀照明。6. 通过目镜(1)观察视场，同时旋转调节手轮(9)，使明暗分界线落在交叉线视场中。如从目镜中看到视场是暗的，可将调节手轮逆时针旋转。看到视场是明亮的，则将调节手轮顺时针旋转。明亮区域是在视场的顶部。在明亮视场情况下可旋转目镜，调节视度看清晰交叉线。7. 旋转目镜方缺口里的色散校正手轮(2)，同时调节聚光镜位置，使视场中明暗两部分具有良好的反差和明暗分界线具有最小的色散。8. 旋转调节手轮，使明暗分界线准确对准交叉线的交点。9. 按READ读数显示键(5)，显示窗中00000消失，显示-，数秒后-消失，显示被测样品的折射率。如要知道该样品的锤度值，可按BX未经温度修正的锤度显示键(8)或按BX-TC经温度修正锤度(按IGUMSA)显示键(6)。nD(7)、BX-TC(6)及BX(8)三个键是用于选定测量方式。经选定后，再按READ键，显示窗就按预先选定的测量方式显示。有时按READ键，显示-，数秒后-消失，显示窗全暗，无其他显示，反映该仪器可能存在故障，需进行检查修理。当选定测量方式为BX-TC或BX时，如果调节手轮旋转超出锤度测量范围(0-95%)，按READ后，显示窗将显示-。10. 检测样品温度，可按TEMP温度显示键(12)显示窗将显示样品温度。除了按READ键后，显示窗显示-时，按TEMP键无效，在其它情况下都可以对样品进行温度检测。显示为温度时，再按nD(7)、BX-TC(6)或BX(8)键，显示将是原来的折射率或锤度。为区分显示值是温度还是锤度，在温度前加t符号，在BX-TC锤度前加C符号，在BX锤度前加b符号。11. 样品测量结束后，必须用酒精或水(样品为糖溶液)进行小心清洁。12. 本仪器折射棱镜部件中有通恒温水结构，如需测定样品在某一特定温度下的折射率，仪器可外接恒温器，将温度调节到你所需温度再进行测量。13.计算机可用RS232连接线与仪器连接。首先，送出一个任意的字符，然后等待接收信息(参数：波特率2400，数据位8位，停止位1位，字节总长18)。二、752型紫外可见分光光度计测定原理利用物质对不同波长光的选择性吸收现象对物质进行定性和定量分析，通过对吸收光谱分析，判断物质的内部结构及化学组成。仪器结构S3-样品3S2-样品2S1-样品1S0-参比样品S3S2S1S0操作步骤及使用方法1. 开机前，先确认仪器样品室内是否有东西挡在光路上。光路上有东西将影响仪器自检甚至造成仪器故障。2. 打开电源开关，使仪器预热20分钟；仪器接通电源后，仪器即进入自检状态，自检结束后波长自动停在546nm处，测量的方式自动设定在透射比方式(%T)，并自动调100%T和0%T。透射比参数测定样品时(透射比方式)：3. 按方式键(MODE)将测试方式设置为透射比方式：显示器显示XXXnm，XXX.X%T4. 按波长设置键()设置分析波长，如340nm；按波长设置键或直到显示器显示340nm为止。此时显示器显示340nmXXX.X%T。每当波长被重新设置后，请不要忘记调整100.0%T。5. 将您的参比溶液和被测溶液分别倒入比色皿中；比色皿内的溶液面高度不应低于25毫米，大约2.5毫升，被测试的样品中不能有气泡和漂浮物，否则，会影响测试参数的精确度。6. 打开样品室盖，将盛有溶液的比色皿分别插入比色皿槽中，盖上样品室盖。被测样品的测试波长在340nm-1000nm范围内时，建议使用玻璃比色皿，190nm-340nm范围内时，建议使用石英比色皿。仪器所附比色皿的透射率已经过测试和匹配，未经匹配处理的比色皿将影响样品的测试精度。比色皿的透光部分表面不能有指印、溶液痕迹。否则，将影响样品的测试精度。7. 将参比溶液推入光路中，按100%T键调整100%T。仪器在自动调整100%T的过程中，显示器显示340nmBlank.，100.0%T调整完成后，显示器显示340nm，100.0%T8. 将被测溶液推或拉入光路中，此时，显示器上所显示是被测样品的透射比参数。注意：测定时要将比色皿的光面对准光路。吸光度参数测定样品时(吸光度方式)：1. 2.（同上）3. 按方式键(MODE)将测试方式设置为吸光度方式：显示器显示XXXnm，X.XXXAbs4. 按波长设置键()设置分析波长，如340nm；按波长设置键或直到显示器显示340nm为止。此时显示器显示340nmX.XXXAbs。每当波长被重新设置后，请不要忘记调整零ABS。5. 将您的参比溶液和被测溶液分别倒入比色皿中；比色皿内的溶液面高度不应低于25毫米，大约2.5毫升，被测试的样品中不能有气泡和漂浮物，否则，会影响测试参数的精确度。6.（同上）7. 将参比溶液推入光路中，按100%T键调整零ABS。仪器在自动调整100%T的过程中，显示器显示340nmBlank.，100.0%T调整完成后，显示器显示340nm，0.000Abs8. 将被测溶液推或拉入光路中，此时，显示器上所显示是被测样品的吸光度参数。浓度值参数测定样品时(浓度直读方式)：1）已知标准样品浓度值：1. 2(同上)3. 按方式键(MODE)将测试方式设置为浓度直读方式：显示器显示XXXnmXXXXC4. 按波长设置键()设置分析波长，如340nm；按波长设置键或直到显示器显示340nm为止。此时显示器显示340nmX.XXXC。每当波长被重新设置后，请不要忘记调整零ABS。5. 将您的参比溶液和被测溶液分别倒入比色皿中；比色皿内的溶液面高度不应低于25毫米，大约2.5毫升，被测试的样品中不能有气泡和漂浮物，否则，会影响测试参数的精确度。6.（同上）7. 将参比溶液推入光路中，按100%T键调整零ABS。仪器在自动调整100%T的过程中，显示器显示340nmBlank.，100.0%T调整完成后，显示器显示340nm，0000C。8. 按功能键，直至显示器上显示STD/CONC=1000。9. 按参数设置键（）直至显示器上显示的参数与标准样品的浓度值相等，如标准样品浓度值为200；此时显示器显示STD/CONC=0200。10. 按确认键，此时显示器显示STD/CONC=0200。11. 将被测溶液推或拉入光路中，此时，显示器上所显示是被测样品的浓度值。2）已知标准样品K因子：17步，如方法1）。8. 按功能键，直至显示器上显示STD/FACTOR=1000。9. 按参数设置键（）直至显示器上显示的参数与标准样品的浓度值相等，如标准样品浓度值为200；此时显示器显示STD/FACTOR=0200。10. 按确认键，此时显示器显示STD/FACTOR=0200。11. 将被测溶液推或拉入光路中，此时，显示器上所显示是被测样品的浓度值。三、GXH-3051型红外线CO2气体分析仪（IRGA）工作原理许多由异原子组成的气体分子对红外线都有特异的吸收带。CO2的红外吸收带有四处，其吸收峰分别在2.69m、2.77m、4.26m和14.99m处，其中只有4.26m的吸收带不与H2O的吸收带重叠，红外仪内设置仅让4.26m红外光通过的滤光片，当该波长的红外光经过含有CO2的气体时，能量就因CO2的吸收而降低，降低的多少与CO2的浓度有关，并服从朗伯一比尔定律。分别供给红外仪含与不含CO2的气体，红外仪的检测器便可通过检测红外光能量的变化而输出反映CO2浓度的电讯号。目前应用于光合作用研究的红外线CO2气体分析仪，按照测量气室的数量一般分为两种类型：单气室类型和双气室（或多气室）类型。单气室红外仪一般用于CO2浓度绝对值的测定；在双气室（或多气室）红外仪中，一个气室为分析气室，另一个作为参比气室，可测定参比气与分析气中CO2浓度之差。仪器结构气室干燥管连接胶管仪器主机仪器后面板示意图仪器前面板及连接示意图仪器启动及操作1. 将仪器从包装箱内取出，接上外接电源，或者切换到内部蓄电池。打开仪器的电源。注意：仪器接通电源后，将发出23秒钟低电压峰呜报警声音，然后仪器正常运转。如果仪器使用蓄电池连续工作若干小时后，仪器将再次长时间发出报警声音，则说明蓄电池电能已快用完，此时应停止使用，待蓄电池充足电后再使用或改用市电220VAC经直流电源转换成l2V给仪器供电。一般充足电的蓄电池可使仪器连续工作45h。2. 仪器接通电源后必须预热15min，这时数显表头显示值为环境空气中CO2的浓度值，约为300350ppm。3. 仪器预热15min后，第一步要校准仪器零点。将仪器后面板的切换阀旋到左侧的调零位置上，打开泵的开关。约lmin后，数显表头的显示值趋向零点附近。此时，旋下零点电位器上的保护盖，调节零点电位器，将显示值调至零点上。4. 第二步要校准仪器跨度。在仪器零点校准结束后，关上气泵的开关，待仪器前面板的切换阀旋到右侧的测量位置上，将l升标准气瓶的出气嘴插入仪器的进气嘴内，轻轻压3次，每次约1秒，然后等待1min左右，待显示值稳定以后，调节跨度电位器使显示值与标准气浓度值一致(若使用带减压阀的高压标准气瓶，应将标准气以0.5 L/min的流量进入仪器内，约1min左右，待显示值稳定以后再进行跨度校准)。5. 测量：用橡胶软管将取样手柄与仪器进气嘴连接上，开泵即可抽取样气进行测量。不取样时可把泵关闭。6. 测量完毕以后，关上电源开关及泵开关，拔下稳压电源插头，将仪器前面板的切换阀打到右侧的测量状态；将仪器后面板的外接供电和电池供电切换开关旋到外接方向。7. 用橡胶管短接样气的进出气口，将其他各连接器件卸下，并整理归位。四、高速离心机测定原理将装有等量试液的离心管对称放置在转头四周的孔内，启动机器后，电动机带动转头高速运转所产生的相对离心力(RCF)使试液分离，相对离心力的大小取决于试样所处的位置至轴心的水平距离即旋转半径r和转速n，其计算公式如下：RCF=1.11810-5n2rg；n-转速(转/分)；r-旋转半径(厘米)仪器结构仪器示意仪器内转头操作步骤1. 将样品等量放置在试管内，并将其对称放入转头。2. 拧紧转轴螺母，盖好盖门，将仪器按上电源后，打开仪器后面的电源开关，此时数码管显示0000，表示仪器已接通电源；3. 如需调整仪器的运行参数(运转时间和运转速度)，可按功能键，使相应的指示灯点亮，数码管即显示该参数值，此时可用，键调整该参数至需要的值，按记忆键确认贮存。4. 按开键启动仪器。仪器运行过程中数码管显示转速，当需要查看其他参数时，可按功能键，使该参数对应的指示灯点亮，数码管即显示该参数值。当仪器到达设定的时间或中途停机，停机过程中数码管闪烁显示转速，属正常现象。注意事项：1. 为确保安全和离心效果，仪器必须放置在坚固水平的台面上，塑料盖门上不得放置任何物品；样品必须对称放置，并在开机前确保已拧紧螺母；2. 应经常检查转头及试验用的离心管是否有裂纹，老化等现象，如有就应及时更换；3. 试验完毕后，需将仪器擦试干净，以防腐蚀；4. 如样品比重超过1.2g/cm3，最高转速n按下式计算：n=nmax(1.2g/样品比重)1/25. 当电机碳刷长度小于6mm时，必须及时更换；6. 在离心机未停稳的情况下不得打开盖门；7. 仪器必须有可靠接地；8. 实验结束后，关闭后面电源开关，拔掉电源插头，下次实验插上电源插头时，勿忘打开后面电源开关。五、DDSJ-308A型电导率仪DDSJ-308A型电导率仪是一台智能型的实验室常规分析仪器，适用于实验室精确测量水溶液的电导率及温度、总溶解固态量(TDS)及温度，也可用于测量纯水的纯度与温度，以及海水及海水淡化处理中的含盐量的测定(以NaCl为标准)。本仪器具有以下特点：(1)仪器可进行电导率、TDS、盐度及温度测量，测量范围：电导率：01.999105s/cm；TDS：019990mg/L盐度：0.080.0ppt；温度：-5.0105.0度(2)仪器采用微处理器技术，使仪器具有自动温度补偿、自动校准、量程自动切换等功能。仪器具有断电保护功能，在仪器使用完毕关机后或非正常断电情况下，仪器内部贮存的测量数据和设置的参数不会丢失。(3)仪器的测量结果可以贮存、删除、查阅、保持、打印或传送到PC机。仪器最多可贮存各50套电导率、TDS或盐度测量的实验数据，并提供两套打印模式供用户选择。(4)具有标定功能，用户可用此功能标定电极常数或TDS转换系数。(5)为方便操作，开机后，仪器将直接进入上次关机时的测量状态。(6)仪器带有RS-232接口，可接TP-16型打印机打印测量结果或与计算机通讯。(7)仪器采用点阵式液晶显示，全中文操作界面，使用简单方便。仪器采用新颖轻触键，可靠性好。仪器结构仪器面板上共有15个操作键，其功能如下：打印1键：用于打印当前的测量数据。打印2键：用于打印贮存的测量数据。查阅键：用于查阅仪器所贮存的测量数据。贮存键：用于贮存测量数据。删除键：用于删除全部贮存的测量数据。标定键：用于标定电极常数或TDS转换系数。电极常数键：用于设置电极常数或TDS转换系数。温补系数键：用于设置温度补偿系数。，键：用于调节参数。保持键：用于锁定本次测量数据。确认键：用于确认仪器当前的操作数据或操作状态。取消键：用于从各种工作状态返回到测量状态。ON/OFF键：用于仪器的开机或关机。仪器安装及使用安装：1. 将多功能电极架(9)插入电极梗座(3)内。2. 将电导电极(10)和温度传感器(12)夹在多功能电极架（9）上。3. 分别将电导电极(10)和温度传感器(l2)的插头插入测量电极插座(5)和温度传感器插座(7)内。4. 用蒸馏水清洗电导电极和温度传感器，然后将电导电极和温度传感器浸入被测溶液中。5. 将通用电源器(11)输出插头插入仪器的电源插座(4)内。然后，接通通用电源器的电源，仪器可以进行正常操作。盐度测量电导电极选用盐度测量时，一般选用电极常数10的电导电极；10ppt以下盐度也可选用电极常数1的铂黑电导电极。测定操作1. 开机：按下ON/OFF键，仪器将显示厂标、仪器型号、名称，即DDSJ-308A型电导率仪。几秒后，仪器自动进入上次关机时的测量工作状态，此时仪器采用的参数为用户最新设置的参数。如果用户不需改变参数，则无需进行任何操作，即可直接进行测量。2. 按模式键可以在三种模式间进行转换（电导率-TDS-盐度）。3. 调节电极常数每支电导电极出厂时，都标有一定的电极常数值，用户需将此值输入仪器。如电导电极的常数为0.98，则具体操作步骤如下：在电导率测量下，按电极常数键，用，键调节常数至0.98值，按确认键，仪器自动将电极常数值0.98存入并返回测量状态，在测量状态中即显示此电极常数值。4. 调节温度系数在电导率或TDS状态下，按温补系数键，仪器进入温补系数调节状态。根据测量溶液的温度系数，按，键修改，最后按确认键，仪器自动将修改好的温度补偿系数存入并返回测量状态。5. 测定将电导电极浸入待测溶液中，待仪器读数稳定后，记录结果即可。6. 测量结束后，按ON/OFF键，仪器关机。将电极卸下，清洗干净后，放回仪器保存箱中。1.2 实验材料的采取、处理与保存植物材料的采集、处理和保存是否恰当是完成植物生理学研究的重要环节之一。植物生理实验使用的材料非常广泛，根据来源可划分为天然的植物材料(如植物幼苗、根、茎、叶、花等器官或组织等)和人工培养、选育的植物材料(如杂交种、诱导突变种、植物组织培养突变型细胞、愈伤组织、酵母等)两大类；按其水分状况、生理状态可划分为新鲜植物材料(如苹果、梨、桃果肉，蔬菜叶片，绿豆、豌豆芽下胚轴，麦芽、谷芽，鳞茎、花椰菜等)和干材料(小麦面粉，玉米粉，大豆粉，根、茎、叶干粉，干酵母等)两大类，因实验目的和条件不同，而加以选择。一、植物材料的采集植物生理研究测定结果和结论的可靠性(或准确性)，在很大程度上取决于材料的选用是否具有广泛的代表性，如果采样方法不科学，样品不具有广泛代表性，即使结果的分析准确无误，也不可能得出正确的结论。样品的采集除必须遵循田间试验抽样技术的一般原则外，还要根据不同测定项目的具体要求，正确采集所需试材。为了保证植物材料的代表性，必须运用科学方法采取材料。从大田或实验地、实验器皿中采取的植物材料，称为“原始样品”，再按原始样品的种类(如植物的根、茎、叶、花、果实、种子等)分别选出“平均样品”，然后根据分析的目的、要求和样品种类的特征，采用适当的方法，从“平均样品”中选出供分析用的“分析样品”。(一)原始样品的取样法1. 随机取样在试验区(或大田)中选择有代表性的取样点，取样点的数目视田块的大小而定。选好点后，随机采取一定数量的样株，或在每一个取样点上按规定的面积从中采取样株。2. 对角线取样在试验区(或大田)可按对角线选定5个取样点，然后在每个点上随机取一定数量的样株，或在每个取样点上按规定的面积从中采取样株。(二)平均样品的取样法1. 混合取样法一般颗粒状(如种子等)或已碾磨成粉末状的样品可以采取混合取样法进行。具体的做法为:将供采取样品的材料铺在木板(或玻璃板、牛皮纸)上成为均匀的一层，按照对角线划分为4等份。取对角的两份为进一步取样的材料，而将其余的对角两份淘汰。再将己取中的两份样品充分混合后重复上述方法取样。反复操作，每次均淘汰50%的样品，直至所取样品达到所要求的数量为止。这种取样的方法叫做“四分法”。一般禾谷类、豆类及油料作物的种子均可采用这种方法采取平均样品，但注意样品中不要混有不成熟的种子及其他混杂物。2. 按比例取样法有些作物、果品等材料，在生长不均等的情况下，应将原始样品按不同类型的比例选取平均样品。例如，对甘薯、甜菜、马铃薯等块根、块茎材料选取平均样品时，应按大、中、小不同类型的样品的比例取样，然后再将每一单个样品纵切剖开，每个切取1/4、1/8或1/16，混在一起组成平均样品。在采取果实的平均样品时，如桃、梨、苹果、柑橘等果实，即使是从同一株果树上取样，也应考虑到果枝在树冠上的各个不同方位和部位以及果实体积的大、中、小和成熟度上的差异，按各自相关的比例取样，再混合成平均样品。(三)取样注意事项1. 取样的地点，一般在距田埂或地边一定距离的株行取样，或在特定的取样区内取样。取样点的四周不应该有缺株的现象。2. 取样后，按分析的目的分成各部分(如根、茎、叶、果等)，然后捆齐，并附上标签，装入纸袋。有些多汁果实取样时，应用锋利的不锈钢刀剖切，并注意勿使果汁流失。3. 对于多汁的瓜、果、蔬菜及幼嫩器官等样品，因含水分较多，容易变质或霉烂，可以在冰箱中冷藏，或进行灭菌处理或烘干以供分析之用。4. 选取平均样品的数量应当不少于供分析用样品的2倍。5. 为了动态地了解供试验用的植物在不同生育期的生理状况，常按植物不同的生育期采取样品进行分析。取样方法系在植物的不同生育时期先调查植株的生育状况并区分为若干类型，计算出各种类型植株所占的百分比，再按此比例采取相应数目的样株作为平均样品。二、分析样品的处理和保存1. 从田间采取的植株样品，或是从植株上采取的器官组织样品一般测定中，所取植株样品应该是生育正常无损伤的健康材料。取下的植株样品或器官组织样品，必须放入事先准备好的保湿容器中，以维持试样的水分状况和未取下之前基本一致。否则，由于取样后的失水，特别是在田间取样带回室内的过程中，由于强烈失水，使离体材料的许多生理过程发生明显的变化，用这样的试材进行测定，就不可能得到正确可靠的结果。对于器官组织样品，如叶片或叶组织，在取样后就应立即放入铺有湿纱布带盖的瓷盘中，或铺有湿滤纸的培养皿中。对于干旱研究的有关试材，应尽可能维持其原来的水分状况。采回的新鲜样品(平均样品)在做分析之前，一般先要经过净化、杀青、烘干(或风干)等一系列处理。(1)净化 新鲜样品从田间或试验地取回时，常沾有泥土等杂质，应用柔软湿布擦净，不应用水冲洗。(2)杀青 为了保持样品化学成分不发生转变和损耗，应将样品置于105的烘箱中烘1520 min以终止样品中酶的活动。(3)烘干 样品经过杀青之后，应立即降低烘箱的温度，维持在7080，直到烘至恒重。烘干所需的时间因样品数量和含水量、烘箱的容积和通风性能而定。烘干时应注意温度不可过高，否则会把样品烤焦，特别是含糖较多的样品，更易在高温下焦化。为了更精密地分析，避免某些成分的损失(如蛋白质、维生素、糖等)，在条件许可的情况下最好采用真空干燥法。此外，在测定植物材料中酶的活性或某些成分(如植物激素、维生素C、DNA、RNA等)的含量时，需要用新鲜样品。取样时注意保鲜，取样后应立即进行待测组分提取；也可采用液氮中冷冻保存或冰冻真空干燥法得到干燥的制品。放在04冰箱中保存即可。在鲜样已进行了匀浆，尚未完成提取、纯化，不能进行分析测定等特殊情况下，也可加入防腐剂(甲苯、苯甲酸)，以液态保存在缓冲液中，置于04冰箱即可。但保存时间不宜过长。2. 已经烘干(或风干)的样品可根据样品的种类、特点进行以下处理:(1)种子样品的处理 一般种子(如禾谷类种子)的平均样品清除杂质后要进行磨碎，在磨碎样品前后都应彻底清除磨粉机(或其他碾磨用具)内部的残留物，以免不同样品之间的机械混杂，也可将最初磨出的少量样品弃去，然后正式磨碎，最后使样品全部无损地通过80100目的筛子，混合均匀作为分析样品贮存于具有磨口玻塞的广口瓶中，贴上标签，注明样品的采取地点、试验处理、采样日期和采样人姓名等。长期保存的样品，贮存瓶上的标签还需要涂蜡。为防止样品在贮存期间生虫，可在瓶中放置一点樟脑或对位二氯甲苯。对于油料作物种子(如芝麻、亚麻、花生、蓖麻等)需要测定其含油量时，不应当用磨粉机磨碎，否则样品中所含的油分吸附在磨粉机上将明显地影响分析的准确性。所以，对于油料种子应将少量样品放在研钵内研碎或用切片机切成薄片作为分析样品。(2)茎杆样品的处理 烘干(或风干)的茎杆样品，均要进行磨碎，磨茎杆用的电磨与磨种子的磨粉机结构不同，不宜用磨种子的电磨来磨碎茎杆。如果茎杆样品的含水量偏高而不利于磨碎时，应进一步烘干后再进行磨碎。(3)多汁样品的处理 柔嫩多汁样品(如浆果、瓜、菜、块根、块茎、球茎等)的成分(如蛋白质、可溶性糖、维生素、色素等)很容易发生代谢变化和损失，因此常用其新鲜样品直接进行各项测定及分析。一般应将新鲜的平均样品切成小块，置于电动捣碎机的玻璃缸内进行捣碎。若样品含水量不够(如甜菜、甘薯等)可以根据样品重加入0.11倍的蒸馏水。充分捣碎后的样品应成浆状，从中取出混合均匀的样品进行分析。如果不能及时分析，最好不要急于将其捣碎，以免其中化学成分发生变化而难以准确测定。有些蔬菜(如含水分不太多的叶菜类、豆类、干菜等)的平均样品可以经过干燥磨碎，也可以直接用新鲜样品进行分析。若采用新鲜样品，可采用上述方法在电动捣碎机内捣碎，也可用研钵(必要时加少许干净的石英砂)充分研磨成匀浆，再进行分析。在进行新鲜材料的活性成分(如酶活性)测定时，样品的匀浆、研磨一定要在冰浴上或低温室内操作。新鲜样品采后来不及测定的，可放入液氮中速冻，再放入-70冰箱中保存。供试样品一般应该在暗处保存，但是，对于供光合、蒸腾、气孔阻力等的测定样品，在光照下保存更为合理。一般可先将这些供试样品保存在室内自然光强下，但从测定前的0.51.0 h开始，应对这些材料进行测定前的光照预处理，也叫光照前处理。这不仅是为了使气孔能正常开放，也是为了使一些光合酶类能预先被激活，以便在测定时能获得正常水平的值，而且还能缩短测定时间。光照前处理的光强，一般应和测定时的光照条件一致。测定材料在取样后，一般应在当天测定使用，不应该过夜保存。需要过夜时，也应在较低温度下保存，但在测定前应使材料温度恢复到测定条件的温度。对于采集的籽粒样品，在剔除杂质和破损籽粒后，一般可用风干法进行干燥。但有时根据研究的要求，也可立即烘干。对叶片等组织样品，在取样后则应立即烘干。为了加速烘干，对于茎秤、果穗等器官组织应事先切成细条或碎块。1.3 实验数据的处理做好实验记录是进行实验结果处理和分析的前提，在实验中观察到的现象及数据，应当及时、准确地记在记录本上，切勿写错，更不能涂改。科学研究要求做到一丝不苟，严谨刻苦，实事求是，这不仅是做学问，而且也是做人的基本准则。在植物生理生化定量测定中，对实验数据进行统计分析，正确运用统计方法非常重要。首先遇到的是实验测定结果中有效数字位数的确定问题。记录数据时，只应保留一位不定数字，计算结果中过多的无效数值是没有意义的，在去掉多余尾数时，以“四舍五入”为原则。在运算过程中，也可以暂时多保留一位不定数字，得到计算结果后，再去掉多余的尾数。其次，在待测组分定量测定中，误差是绝对存在的，因此必须善于利用统计学的方法，分析实验结果的正确性，并判断其可靠程度。实验中，每种处理至少要有三次重复，定量测定数据也要有三次重复，否则，无法进行统计检测。而且，在统计分析之前，不能单就数据进行选择统计。由于取材误差、仪器误差、试剂误差、操作误差等一些经常性的原因所引起的误差称为系统误差；由于一些偶然的外因所引起的误差，称为偶然误差。前者影响分析结果的准确度，后者影响分析结果的精密度。所谓准确度是指测得值与真实值符合的程度，它用误差来表示。误差分为绝对误差和相对误差。所谓精密度是指几次重复测定彼此间符合的程度，显示其重现性状况，它用偏差来表示。偏差也分为绝对偏差和相对偏差。准确度和精密度共同反映测定结果的可靠性。误差小表示可靠性好，误差大表示可靠性差。在对实验结果进行分析时，对同一待测组分所得到的多个实验数据，最简单的办法是计算其算术平均值，但这还不能很好地反映测定结果的可靠性，尚需要计算出偏差或相对偏差。在分析中，如果实验数据不多，则可采用算术平均偏差或相对平均偏差表示精密度即可；但当实验数据较多或分散程度较大时，用标准偏差即均方差S或相对标准偏差即变异系数Cv表示精密度更可靠。还可用置信区间表示指定置信度的偏差。1. 算术平均值=2. 平均偏差3. 相对平均偏差=100%4. 标准偏差(均方差)S=5. 变异系数Cv= 100%6. 置信区间的界限P=置信区间=土P在科学研究中，为了检测某一样品所属总体平均数和某一指定的同类样品的总体平均数之间，或者两种处理取样所属的总体平均数之间有无显著差异时，在总体方差未知，又是小样本情况下，可以用t检验求得t值，再根据设定显著水平和自由度大小，从t值表中查得概率值(P)，即可推断不同样品或同一样品的不同处理之间是否具有显著性差异及其差异水平。所谓t检验，实质上是差数的5%和1%置信区间，它只适用于检验两个相互独立的样品平均数。要明确多个平均数之间的差异显著性，还必须对各平均数进行多重比较。多重比较的方法，过去沿用最小显著差数法(简称LSD法)，但此法有一定的局限性。近来多采用最小显著极差法(简称LSR法)，这一方法的特点是不同平均数间的比较采用不同的显著差数标准，可用于平均数间的所有相互比较，其常用方法有新复极差检验和q检验两种。各平均数经多重比较后，常采用标记字母法表示。在平均数之间，凡有一个相同标记字母的即为差异不显著，凡具有不同标记字母的即为差异显著，用小写字母a、b、c等表示=0.05显著水平，大写字母A、B、C等表示=0.01显著水平。差异显著性也可用标“*”号的方法表示，凡达到=0.05水平(差异显著)的数据，在其右上角标一个“*”号，凡达到=0.01水平(差异极显著)的数据，在其右上角标两个“*”号，凡未达到=0.05水平的数据，则不予标记。在科学实验中，方差分析可帮助我们掌握客观规律的主要矛盾或技术关键。方差分析的基本步骤可概括为：将资料总变异的自由度及平方和分解为各变异因素的自由度及平方和，进而算得其均方差；计算均方比，做出F测验，以明确各变异因素的重要程度；对各平均数进行多重比较。具体的方法可参考有关专业书籍。思考题1. 如何做到采取的植物材料具有广泛的代表性?2. 如何做到对实验结果进行科学的统计和分析2. 水分生理2.1 气孔运动及其影响因素气孔是陆生植物与外界环境交换水分和气体的主要通道及调节机构。它既要让光合作用需要的CO2通过，又要防止过多的水分损失，因此气孔在叶片上的分布、密度、形状、大小以及开闭情况显著地影响着叶片的光合、蒸腾等生理代谢的速率。因而研究气孔状况很有必要，特别是在研究化学物质及环境因素对气孔运动的影响时，经常需要观察或测定气孔开闭的程度。本实验介绍观察气孔状况的一些方法。一 显微镜下观察气孔运动原理 气孔的开闭运动是由组成气孔器的两个保卫细胞的膨压控制的，将叶片表皮放在高渗溶液中，保卫细胞失水，气孔关闭；置换成低渗溶液后，保卫细胞吸水，气孔开启。气孔的开闭运动可在显微镜下直接观察。仪器与用具 显微镜1台；尖头镊子1把；载玻片；盖玻片；滤纸；滴管等。试剂5甘油溶液。方法 选用气孔较大的植物，如鸭跖草、蚕豆等进行实验。实验前先把植株放在湿润的空气中照光，促使气孔张开。观察时摘下叶片，用尖头镊子撕取一小片下表皮，浸入有水滴的载玻片上，盖上盖玻片后立即在显微镜下观察。尽可能找到开得最大的气孔，然后在盖玻片的一端用滤纸吸去水；而从另一端滴上5甘油溶液，使甘油溶液取代水，继后可观察到保卫细胞因失水而质壁分离，致使气孔关闭。当按上述方法再用水取代甘油时，保卫细胞吸水便呈现质壁分离复原现象，气孔张开，而且张得比实验开始时还大。注意事项 本方法适用对气孔大且易撕下表皮的植物进行气孔运动的观察。二、光、CO2对气孔运动的影响原理 光下植物叶片的气孔开启，暗中气孔关闭。一般情况下，高CO2抑制气孔张开，而低CO2诱导气孔开放。气孔的形态，大小及气孔开度可在显微镜下直接观察。 仪器与用具 有光源的显微镜1台；显微聚光灯1盏；载玻片；镊子；滴管；吸水纸；测微尺等。试剂1mol/L NaOH方法 1. 光对气孔的开启将不离体的叶片(鸭跖草或蚕豆等)冲洗干净，放置暗中数小时，使气孔关闭，然后把一张平展的叶片固定在显微镜的载物台上，有气孔的一面朝上，开启显微镜的内藏式光源或在叶的斜上方安置一显微聚光灯，照射叶片，视野中选择数个气孔，调焦后，每隔510min观察一次，并用显微测微尺测量气孔开度。也可用显微摄影仪定时定点拍摄光诱导的气孔开启过程。2. 气孔对CO2的反应将盛有表皮条和少量水的小培养皿放在一盛有1 mol/L NaOH 溶液的大培养皿中，用烧杯罩住，其中CO2被NaOH所吸收，放在室温、光照下30min，处理前后测量气孔孔径。注意事项 1.观察的叶片最好是在温室中生长的，叶表面沾污的尘粒少。2.事先对叶遮光处理。3.样品下表皮朝向光源。三、钾离子对气孔开度的影响原理 保卫细胞的渗透系统受钾离子调节。光下，保卫细胞中的叶绿体通过光合磷酸化生成ATP，ATP驱动质膜上的K+-H+泵，使保卫细胞能逆浓度梯度从周围表皮细胞吸收钾离子，或从外界溶液中吸收钾离子，从而降低其渗透势，使气孔开放。仪器与用具 显微镜1台；尖头镊子1把；光源灯(1000W碘钨灯)；培养皿 3个，载玻片与盖玻片若干。 试剂 0.5KNO3；0.5NaNO3；须用分析纯试剂配制。方法 1. 将三个培养皿中各放15ml的0.5KNO3、0.5 NaNO3与蒸馏水。2. 在同一蚕豆叶上撕表皮若干，分放在上述的三个培养皿中。3. 将培养皿置于人工光照条件下照光l2 h左右，光照强度在40001x左右。4. 分别在显微镜下观察气孔的开度。注意事项1. 供试材料除蚕豆外，还可选用鸭跖草和紫鸭跖草，实验前，要给材料预照光，促使气孔适度开放，这样可缩短实验时间，提高处理效应。2. 室温低时，将照光培养皿放置得离光源稍近一些，使培养皿中溶液温度能上升至3035。四、ABA等植物激素对气孔关闭的作用原理 植物内源激素ABA(脱落酸)、SA（水杨酸）、JA（茉莉酸）、IAA（生长素）等均能够影响气孔的开闭运动。可以用称量法、镜检法直接或间接地测量气孔开度，以检验外源ABA、SA、JA、IAA的作用，加深了解ABA、SA、JA、IAA的生理功能。仪器与用具 显微镜1台(附接目镜测微尺)；温箱1台；感量0.001g天平；25ml 烧杯6只；10ml 移液管3支；剪刀1把；尖头镊子1把；光源；载玻片和盖玻片等。试剂1mmol ABA；1mmol SA；1mmol IAA；1mmol 6-BA；pH6.1的10mmol/L Tris或MES缓冲液：蒸馏水；无水乙醇；方法1. 取34周龄蚕豆幼苗最上端刚展开的叶片，放在光下照光（做ABA、SA）或暗处（做IAA）23h，诱导气孔关闭或张开。在显微镜下记录气孔孔径。2. 用pH6.1的10mmol/L Tris缓冲液配制不同浓度的IAA、6-BA和ABA溶液（0、10-4、10-5和10-6mol/L）。3. 取气孔下表皮，分别放入以上缓冲液中，在散射光下23 h，测量各处理和对照的气孔孔径，作出激素浓度和孔径的关系图。4. 根据测量结果，分析各激素对气孔开度的影响。注意事项1. 测量前为何要进行照光或暗处理?2. ABA为何能影响气孔开度? 五、Ca2+在ABA调节气孔运动中的作用原理 Ca2+是ABA调节气孔运动信号转导的重要组分之一。激光共聚焦显微镜技术（Conforcal）证明在ABA诱导蚕豆气孔关闭会出现 Ca2+i(胞质钙浓度)升高现象，Ca2+通道阻断剂EGTA、钌红、LaCl3和异博定（verapamil ）可阻断ABA所引起的Ca2+i(胞质钙浓度)升高，抵消或减弱ABA诱导气孔关闭的效应。仪器与用具有光源的显微镜1台；载玻片；镊子；滴管；吸水纸；测微尺等。试剂100 mmol/L KCl溶液； pH6.1的10mmol/L Tris或MES缓冲液；100 mmol/L CaCl2溶液；20 mmol/L EGTA；10mmol/L LaCl3方法1. 取34周龄蚕豆幼苗最上端刚展开的叶