基因工程及其应用4 (2).ppt

第八章 基因工程及其在医药学中的应用 重组DNA技术 DNARecombinationTechnique 基因工程相关概念 基因工程相关的酶学 基因工程的载体 目的基因的制备和分离方法 载体与目的基因的连接 重组体的鉴定与分析 隆基因的表达 本章主要内容 重组DNA技术的发展史 年G J Mendel的豌豆杂交试验1944年O T Avery的肺炎球菌转化实验1973年美国斯坦福大学的科学家构建第一个重组DNA分子1977年美国南旧金山由博耶和斯旺森建立世界上第一家遗传工程公司 专门应用重组DNA技术制造医学上重要的药物 1980年开始建造第一家应用重组DNA技术生产胰岛素的工厂1997年英国罗林研究所成功的克隆了多莉 一 重组DNA技术相关概念 克隆 clone 来自同一始祖的相同副本或拷贝的集合 获取同一拷贝的过程称为克隆化 cloning 即无性繁殖 一 DNA克隆 2 克隆化 cloning 1 分子克隆 molecularclone 即DNA克隆 2 细胞克隆 3 个体克隆 动物或植物 技术水平 细胞的分化潜能 全能性 totipotency 一个细胞在一定条件下具有发育成完整个体的潜能 称为细胞的全能性 totipotency 具有这种潜能的细胞称为全能性细胞 细胞核全能性 3 DNA克隆应用酶学的方法 在体外将各种来源的遗传物质与载体DNA接合成一具有自我复制能力的DNA分子 复制子 replicon 继而通过转化或转染宿主细胞 筛选出含有目的基因的转化子细胞 再进行扩增 提取获得大量同一DNA分子 也称基因克隆或重组DNA recombinantDNA DNA克隆目的 分离获得某一感兴趣的基因或DNA 获得感兴趣基因的表达产物 蛋白质 重组DNA技术操作的主要步骤 目录 二 工具酶 限制性核酸内切酶DNA聚合酶 DNA连接酶逆转录酶碱性磷酸酶末端转移酶TaqDNA聚合酶 1 限制性核酸内切酶 restrictionendonuclease RE 1 定义识别DNA的特异序列 并在识别位点或其周围切割双链DNA的一类内切酶 BamH 与甲基化酶共同构成细菌的限制修饰系统 限制外源DNA 保护自身DNA 稳定细菌遗传性状 2 分类 作用 基因工程技术中常用 型 第一个字母取自产生该酶的细菌属名 用大写 第二 第三个字母是该细菌的种名 用小写 第四个字母代表株 用罗马数字表示发现的先后次序 3 命名 EcoR EscherichiacoliRY13株大肠杆菌RY13株的第一种酶 4 类酶识别序列特点 回文结构 palindrome 切口 平端切口 粘端切口 BamH Hind 平端切口 粘端切口 同功异源酶来源不同的限制酶 但能识别和切割同一位点 这些酶称同功异源酶 BamH Bst 同尾酶有些限制性内切酶虽然识别序列不完全相同 但切割DNA后 产生相同的粘性末端 称为同尾酶 这两个相同的粘性末端称为配伍未端 compatibleend BamH Bgl 2 DNA聚合酶 3 TaqDNA聚合酶 TagDNApolymerase 是一种耐热的依赖于DNA的DNA聚合酶 具有 聚合酶活性 该酶最适反应温度为75 80 4 逆转录酶 5 Klenow片段 6 DNA连接酶 DNAligase 功能 催化DNA中相邻的5 磷酸基和3 羟基末端之间形成磷酸二酯键 使DNA切口封合或使两个DNA分子或片段连接 7 多聚核苷酸激酶 8 末端转移酶 三 目的基因 cDNA complementaryDNA 基因组DNA genomicDNA 9 碱性磷酸酶 三 基因载体 cloningvector 1 概念 携带目的基因 实现其无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些DNA分子 来源分类 质粒载体噬菌体载体病毒载体人工染色体载体 用途分类 克隆载体表达载体穿梭载体 2 常用载体 克隆载体 cloningvector 能使插入的外源DNA序列被复制 扩增而不能表达 这样的载体为克隆载体 表达载体 expressionvector 使插入的外源DNA序列转录翻译 表达出多肽链 这样的载体称为表达载体 这类载体中含有来源不同的复制子结构 即具备原核细胞复制所需的序列结构 又具有能使外源片段在真核细胞表达所需的结构元件和相应的选择标记基因 所以能在两种受体细胞中复制并检测 克隆的外源基因在此类载体直接从一种受体转入另一种受体中进行复制和表达 穿梭载体 shuttlevector 3 载体具备以下条件 1 具有自我复制能力 具有多个单一限制性酶切位点 具有选择性遗传标记 分子量小 拷贝数高 具有较高的遗传稳定性 松弛型的复制子 多克隆位点 筛选标记 常见 质粒 噬菌体 克隆载体必需结构 具有复制子 筛选标记 位于多克隆位点的上下游具有转录效率较高的启动子 起始密码子和核糖体结合位点 转录终止子结构 表达载体结构特点 概念 存在于细菌染色体外的能独立复制的双链闭环的DNA分子 质粒 plasmid 分子量相对较小 能在细菌内稳定存在 能在宿主细胞内独立自主复制 具有某些遗传标志 会赋予宿主细胞一些遗传性状 具有多个限制酶的单一位点 多克隆位点 质粒特点 细菌质粒 质粒的复制类型 严谨型 strigentplasmid 复制与宿主染色体同步受宿主染色体复制的限制 在宿主细胞中拷贝数低约 份拷贝 松弛型 relaxedplasmid 复制不受宿主染色体复制的限制可独立复制 在宿主细胞中拷贝数高 基因工程常用载体 常用质粒载体种类 pBR322pUC pBR322 人工构建重要质粒 优点 具有较小的分子量 具有两种抗生素抗性基因 可作为筛选标记 具有高拷贝数 是松弛型质粒 目录 pUC质粒特点 来源于pBR322质粒的复制起始点 具有两种抗生素抗性基因 但基因内无核酸内切酶位点 含有大肠杆菌 半乳糖苷酶 肽段编码基因统称LacZ 基因 靠近LacZ 基因 端有一段多克隆位点 影响LacZ 基因功能 含有一个调节LacZ 基因表达的阻遏蛋白基因LacI pUC质粒优点 具有更小的分子 更高的拷数 适于组织化学检测重组体 噬菌体 phage 噬菌体DNA改造系统 gt系列 插入型 适用cDNA克隆 EMBL系列 置换型 适用基因组克隆 噬菌体 phage 载体系统分类 M13噬菌体DNA改造系统 含lacZ基因 M13mp系列pUC系列 左臂 右臂 非必需序列 插入单一酶切位点或一对内切酶位点 噬菌体DNA改造系统 粘性质粒 cosmid 结合质粒克隆载体和 噬菌体克隆载体的优点 结构 质粒DNA接上 噬菌体粘性末端 cos 粘性质粒 cosmid 具有 噬菌体粘性末端特性 具有质粒耐药性标记 具有多个限制性酶切位点 具有高容量的克隆能力 接上真核细胞复制子和启动子及选择标记 就能在真核细胞中存在和表达 粘性质粒的特点 酵母人工染色体 yeastartificialchromosome YAC 细菌人工染色体 bacterialartificialchromosome BAC 动物病毒DNA改造的载体 如腺病毒 腺病毒相关病毒 逆转录病毒 其它 四 目的基因 cDNA complementaryDNA 基因组DNA genomicDNA 一 目的基因的获取 1 化学合成法要求 已知目的基因的核苷酸序列或其产物的氨基酸序列 2 基因组DNA文库 genomicDNAlibrary 3 cDNA文库 cDNAlibrary 4 聚合酶链反应 polymerasechainreaction PCR 见第22章 化学合成获取目的基因 化学合成法获取目的基因 由已知氨基酸序列推测可能的DNA序列 分子文库 基因组DNA文库获取目的基因 genomicDNAlibrary 组织或细胞染色体DNA 基因片断 克隆载体 重组DNA分子 含重组分子的转化菌 限制性内切酶 受体菌 基因组DNA文库存在于转化细胞内由克隆载体所携带的所有基因组DNA的集合 从基因组DNA文库获取目的基因 目录 目录 cDNA文库获取目的基因 cDNAlibrary 目录 引物 cDNA文库 基于核酸杂交的筛选 基于抗原抗体反应的筛选 在文库中筛选目的基因原理 聚合酶链反应获取 polymerasechainreaction PCR 5 Primer1 5 Primer2 5 5 TemplateDNA PCR基本工作原理 目录 目录 PCR的基本反应步骤 变性95 C 延伸72 C 退火Tm 5 C 模板DNA特异性引物耐热DNA聚合酶dNTPsMg2 PCR体系基本组成成分 五 目的基因与载体的连接 经限制酶作用于目的基因与载体DNA 在连接酶催化下 来源不同双链DNA片段 断端重新形成 磷酸二酯键的过程 连接原理 粘性末端连接 平端连接 一端粘性末端与另一端平端连接 连接方式 方式 1 同一限制酶切位点连接 2 不同限制酶切位点连接配伍末端连接非配伍末端连接 粘性末端连接 BamH 切割反应 T4DNA连接酶15 C 同一限制酶切位点连接 目录 不同限制酶切位点 非配伍末端 的连接 EcoR 切割位点 Bgl 切割位点 配伍末端的连接情况和同一限制酶切位点连接相似 目录 定向克隆 适用于 限制性内切酶切割产生的平端或粘端补齐或切平形成的平端 T4DNA连接酶催化平端连接 平端连接 目录 在末端转移酶 terminaltransferase 的作用下 在DNA片段末端加上同聚物序列 制造出粘性末端 再进行粘端连接 同聚物加尾连接 载体DNA 目的基因 限制酶或机械剪切 限制酶 目录 由平端加上新的含有限制性酶切位点的接头 再用限制酶切除产生粘性末端 而进行粘端连接 人工接头 linker 连接 人工接头及其应用 目录 六 重组DNA导入受体菌 受体菌条件 安全宿主菌 限制酶和重组酶缺陷 受体菌处于感受态 competent 感受态 competent 指细胞在一定的生理状态可摄取外源性遗传物质经体内重组成为染色体中的一部分 导致受体细胞某些遗传性状的改变 经人工处理能吸收重组DNA分子敏感状态的宿主细胞 称之为人工感受态细胞 导入方式 转化 transformation 转染 transfection 感染 infection 转化 transformation 以质粒为载体构建的重组DNA分子导入原核细胞的过程 转染 transfection 以噬菌体或病毒为载体构建重组DNA分子导入真核细胞的过程 感染 infection 以人工改造的噬菌体或病毒为载体构建重组DNA分子 经体外包装成具有感染性噬菌体或病毒颗粒后 借助于噬菌体或病毒的蛋白外壳将重组DNA分子注入细菌或真菌细胞 从而使目的基因得以复制的过程 七 重组体的筛选 1 抗药性标记选择 2 标志补救 markerrescue 3 分子杂交法原位杂交Southern印迹 1 直接选择法 2 免疫学方法如免疫化学方法及酶免检测分析等 限制性内切酶图谱 双脱氧终止法测序 sanger法 目录 插入失活法 抗药性标记选择 组氨酸缺陷型大肠杆菌 无组氨酸的培养基 酵母咪唑甘油磷酸脱水酶基因 促进组氨酸合成 DNA 重组体 标志补救 目录 互补的检测 目录 原位杂交 目录 核酸杂交 Southern印迹 目录 鸡的 肌球蛋白的克隆和检出 目录 重组DNA技术操作的主要步骤 目录 以质粒为载体的DNA克隆过程 重组DNA技术操作过程可形象归纳为 小结 八 克隆基因的表达 将外源目的基因克隆到表达载体上 导入受体细胞的过程称为外源基因的表达 外源基因的表达 外源基因的表达涉及目的基因的克隆 复制 转录 翻译 蛋白质产物的加工及分离纯化等过程 表达载体的构建受体细胞的建立表达产物的分离纯化 外源基因的表达步骤 外源基因在原核细胞中的表达 原核表达系统就是将克隆的外源基因导入原核细胞 使其在细胞内快速 高效地表达基因产物 主要有大肠杆菌 芽孢杆菌及链霉菌系统等 E coli表达体系最为常用组成 选择标志强启动子翻译调控序列多接头克隆位点 原核表达体系 表达载体pFASTBACI的物理图谱 不宜表达真核基因组DNA 不能加工表达的真核蛋白质 表达的蛋白质常形成不溶性包涵体 inclusionbody 很难表达大量可溶性蛋白 E coli表达体系的不足 外源基因在原核细胞中的表达 1 融合型表达蛋白 所谓融合型表达是指将外源目的基因与宿主结构基因相拼接构建成融合基因进行表达 这样产生的蛋白质的N末端为宿主基因序列 可以是原核DNA或其它DNA序列 编码 C末端由外源目的基因编码 2 非融合型表达蛋白 是指外源目的基因不与宿主基因融合 直接从起始密码AUG开始在原核调控元件控制之下表达外源基因蛋白质 非融合型表达的蛋白质具有类似天然蛋白质的结构 其生物学功能也更接近于体内的天然蛋白质 但其缺点是容易被细菌蛋白酶降解 3 分泌型表达蛋白 分泌型表达是利用具有信号肽编码序列的分泌型表达载体 将表达的蛋白质由细胞质跨膜分泌到细胞基质或细胞周质中 强启动子及其调控序列 SD序列 SD序列下游携带有一段信号肽序列 常用的信号肽有OmpA PelB PhoA和Hly等 分泌型表达载体组成 需注意是 不同蛋白质的分泌需要不同的信号肽 大鼠胰岛素原cDNA的表达和分泌 目录 外源基因在真核表达 克隆基因含有 原核克隆载体的复制子抗性筛选基因限制性内切酶酶切位点序列 真核表达载体 真核表达载体大多是穿梭载体 表达基因真核细胞的启动子 增强子 剪接信号 转录终止信号PolyA化信号遗传选择标记等组件 真核表达体系 酵母 昆虫 乳类动物细胞 真核表达体系优点 可表达克隆的cDNA及真核基因组DNA可适当修饰 表达的蛋白质表达产物