如何确定引物浓度-pmol为单位的引物转换为.doc

如何确定引物浓度一般合成的寡聚体DNA（Oligo DNA）均以OD260来单位来表示的。所谓OD260值是指在1ml体积1cm光径标准比色杯中，260nm波长下吸光度为1 A260的寡聚体DNA溶液被定义为1 OD260。因此，根据此定义，1OD260单位相当于33ug的寡聚体DNA，从而可根据寡聚体DNA的OD260值及其自身分子量来计算得到摩尔数，以计算不同浓度的溶液。 1.寡聚体DNA分子量（MW）的精确算法： 一般而言，寡聚体DNA的精确分子量可根据下述公式进行计算： MW（A碱基数312）（C碱基数288）（G碱基数328）（T碱基数303） 61 例：TGGGCGGCGGTTGGTGTTACG A=1 C=3 G=11 T=6 MW （1312）（3288）（11328）（6303） 61 6541 2.寡聚体DNA分子量（MW）的粗略算法： 由于寡聚体DNA中的每个脱氧核苷酸的平均分子量近似于324.5，因此，一条寡聚体DNA的分子量粗略算法为： MW 碱基数bp324.5 粗略算法示例：1 OD260 的20-mer Oligo DNA，则 分子量 20324.5 6490 质量数 133 33ug 摩尔数 33/6490 0.005umol 5nmol 3.寡聚体DNA摩尔数的粗略算法： 即1个OD260值的X-mer Oligo DNA摩尔数计算公式为： Y nmol 33ug （Xbp324.5）核酸吸光度、分子量、摩尔浓度之间的相互换算光度计测量的转换: 双链DNA (ds DNA)：A260 = OD260 = 1 相当于50 g/ml溶液单链DNA(ss DNA)：A260 = OD260 = 1相当于33 g/ml溶液RNA：A260 = OD260 = 1相当于40 g/ml溶液参考文献：Freifelder, D., Physical Biochemistry: Applications to Biochemistry & Molecular Biology, W.H. Freeman and Company, CA, 1982, p. 494-536. 核酸分子量计算方程式： 吸光度(A)摩尔消光系数浓度长度500 bp的双链DNA325,000 Daltons500 nt*的单链DNA162,500 Daltons*nt = nucleotidedNMP的平均分子量325 Daltons寡聚体定量：20-mer，A260 = 1的贮存液含有5 nmol寡聚体：5 nmol = 33 g/(20325) 40-mer，A260 = 1的贮存液含有5 nmol寡聚体：2.5 nmol = 33 g/(40325) pmol为单位的引物转换为g为单位的引物：（X pmoles长度bp325）/ 1,000,000 例：10pmoles的25-mer，则为（10pmol25bp325）/ 1,000,000 = 0.081 g primer g为单位的引物转换为pmol为单位的引物：（X pmoles1,000,000）/（长度bp 325）例：0.1g的20-mer，则为（0.1g1,000,000）/（20bp325）= 15.4 pmoles primer PCR扩增反应引物浓度的计算：引物毫摩尔浓度（mM）= pmoles/l例1：100l PCR反应体系中有20pmol的引物 = 0.20 mM例2：引物为24bp，并溶解于0.1ml l H2O中；10l溶液稀释至1.0ml测定其A260为：A260 = OD260 = 0.76；则贮存液在260nm（A260）的吸光度为76；0.1ml的贮存液含有7.6个单位的A260；引物碱基组成为：A=6, C=6, G=6, T=6；260nm引物的摩尔消光系数 = a(16,000) + b(12,000) + c(7,000) + d(9,600)注：a、b、c、d分别是 As、Gs、Cs、Ts的碱基个数；PCR引物的摩尔消光系数= 6(16,000) + 6(12,000) + 6(7,000) + 6(9,600) = 267,600则PCR引物贮存液的摩尔浓度为：76/267,600 = 284 mM转速有离心力（g）和每分钟转速（rpm)两种表示方式，有些离心机没有自动切换功能。下面的公式可以帮助解决这个问题：g=r11.1810-6rp