SDS-PAGE电泳试剂配制.doc

SDS-PAGE电泳试剂1) 30%储备胶溶液：丙烯酰胺（Acr）29.0g，亚甲基双丙烯酰（Bis）1.0g，混匀后加ddH2O，37OC溶解,定容至100 mL,棕色瓶存于4OC；2) 1.5M Tris-HCl(pH 8.8)： Tris 18.17g加ddH2O溶解,浓盐酸调pH至8.0,定容至100mL；3) 1M Tris-HCl(pH 6.8)： Tris 12.11g加ddH2O溶解,浓盐酸调pH至6.8,定容至100 mL；4) 4分离胶缓冲液： 0.4gSDS溶于1.5M Tris-HCl(pH 8.8)，定容至100mL；5) 4浓缩胶缓冲液： 0.4gSDS溶于1M Tris-HCl(pH 6.8)，定容至100mL；6) 10电泳缓冲液(pH 8.3)： Tris 3.029g，甘氨酸14.415g，SDS 1g加ddH2O溶解,定容至100mL；7) 10%过硫酸铵（Aps,现配）： 1g AP加ddH2O至10mL；8) 2SDS电泳上样缓冲液： 1M Tris-HCl(pH 6.8)2.5mL，b-巯基乙醇1.0mL，SDS 0.6g，甘油2.0 mL，0.1%溴酚兰 1.0 mL，ddH2O 3.5mL；9) 考马斯亮兰染色液： 考马斯亮兰R2501.25g，甲醇225 mL，冰醋酸50 mL，ddH2O 225mL；10) 脱色液: 甲醇、冰醋酸、ddH2O以217配制而成；11) 分离胶(12.5%): ddH2O 4mL，30%储备胶5 mL， 4分离胶缓冲液3mL, 10% Aps 0.1mL(现配)，TEMED(N,N,N,N-四甲基乙二胺)10L；12) 浓缩胶（5）： ddH2O 2.65mL，30%储备胶0.85mL，4浓缩胶缓冲液1.25mL， 10%Aps 50L，TEMED 5L。Tricine（三羟甲基氨基甘氨酸）- SDS - PAGE蛋白质电泳1 Tricine - SDS - PAGE蛋白质电泳溶液准备1） 正极缓冲液(10 )：14g Tris 溶于400mL 重蒸水,用1. 0M HCl 调至pH8. 9 ,定容至500mL。2） 负极缓冲液(10 )： 将60. 55g Tris ,89. 58g Tricine 及5g SDS 溶于400ml 重蒸水中,加水至终体积为500mL。3） 凝胶缓冲液(3 )：将181. 5g Tris ,1. 5g SDS 溶于400mL 重蒸水中,用1M HCl滴定至pH8. 45 ,再加水稀释至500mL。2 丙烯酰胺储存液配制1） 3C-丙烯酰胺储存液(3C-stock)将48g 丙烯酰胺和1. 5g 甲叉双丙烯酰胺溶于重蒸水中配成100mL 49. 5 %的储存液。2） 5C-丙烯酰胺储存液(5C-stock)用重蒸水溶解47g 丙烯酰胺和2. 5g 甲叉双丙烯酰胺成100mL 49. 5 %的储存液。3 Tricine-SDS-PA GE 的凝胶制作1） 小孔胶3mL : 1mL 凝胶缓冲液(3x)、0. 4 g 甘油、1mL“6 C 凝胶储存液”、用去离子水稀释至3 mL , 临用时加入10 L 的10% 过硫酸氨溶液和1 L 的TEMED。2） 夹层胶3 mL: 1 mL 凝胶缓冲液(3x)、0. 61 mL“3C凝胶储存液”, 用去离子水稀释至3 mL , 临用时加入10L 的10% 过硫酸氨溶液和1 L 的TEMED。3） 浓缩胶2 mL : 0. 5 mL 凝胶缓冲液(3x)、0. 16 mL“3C 凝胶储存液”, 用去离子水稀释至2 mL , 临用时加入10 L 的10% 过硫酸氨溶液和1 L 的TEMED。用垂直小电泳槽制胶电泳。先铺小孔胶, 接着均匀注入夹层胶, 凝胶聚合后再铺浓缩胶。变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDSPAGE)分析 1）准备：电泳玻璃板用双蒸水洗净，戴上手套再用无水乙醇擦拭玻璃板、梳子等并晾干，按说明安装好电泳装置。2）12.5%分离胶灌制取一洁净的20mL烧杯，分别加入：ddH2O 4mL30%储备胶 5mL 4分离胶缓冲液 3mL10% Aps(现配) 0.1mL 100%TEMED 0.01mL轻轻旋转混匀溶液，用5mL移液器灌入玻璃板间，以水封顶，使液面平整。3）5浓缩胶灌制取一洁净的20mL烧杯，分别加入：ddH2O 2.65mL30%储备胶 0.85mL4浓缩胶缓冲液 1.25mL10% Aps 50 L100%TEMED 5 L待分离胶凝聚后，再配制5%的积层胶，将分离胶上的水倒去，灌入积层胶，立即将梳子插入玻璃板间，待积层胶聚合后，拔出梳子，用蒸馏水洗尽凝胶顶部。4）上样与电泳将凝胶玻板置于电泳槽中，加入事先准备好的电泳缓冲液，加样完毕后，使样品端与阴极连通，另一端与阳极相连，根据本试验蛋白质大小等各项特性，分离胶选用120V固定直流电压，积层胶选用60V固定直流电压，当样品中溴芬兰色带快接近凝