乳酸菌检测方法.doc

1、 乳酸菌检测方法植物乳杆菌的检验1原理 植物乳杆菌能在相应的厌氧培养条件下，于MRS培养基表面生长成白色、细密、圆形光滑突起的菌落，根据长出的菌落数和稀释倍数，计算出活菌数。2仪器与试药2.1 仪器 超净工作台、高压蒸汽灭菌器、恒温干燥箱、电冰箱、恒温培养箱（601）、恒温水浴锅、显微镜（10x100x）、架盘天平（0500g，精确至0.5g）、250ml锥形瓶、250ml盐水瓶、灭菌吸管：1ml(具0.01ml刻度）、10ml(具0.1ml刻度）、灭菌平皿（直径90mm）、灭菌试管（15mm160mm）、灭菌L型玻璃棒等。2.2 试药 酪蛋白胨、牛肉浸膏、酵母提取物、琼脂等均为生化试剂；无水乙酸钠、柠檬酸三胺、硫酸镁、硫酸锰、葡萄糖、磷酸氢二钾、碳酸钙、吐温-80、氯化钠等均为分析纯；水为双蒸馏水，其他化学试剂均为分析纯。2.3 MRS琼脂培养基的组成与制备2.3.1培养基的组成 酪蛋白胨10g、牛肉浸膏10g、酵母提取物5g、葡萄糖20g、无水乙酸钠5g、柠檬酸三胺3g、硫酸镁0.5g、硫酸锰0.2g、磷酸氢二钾2.0g、碳酸钙20g、吐温-801ml、琼脂15g、蒸馏水1000ml。2.3.2培养基制备将上述的各组分在8090加热使溶解，校正pH6.2，加蒸馏水至1000ml中，摇匀，分装于盐水瓶，每瓶100ml。在121高压灭菌20分钟，冷却后备用。2.4营养琼脂平板的制备 取冷至45左右的MCA琼脂培养基，在无菌的条件下倒入无菌的培养皿中，每平皿各约15ml，待冷却凝固后，备用。2.5无菌生理盐水的制备 称取氯化钠9.0g，用蒸馏水溶解并定容于1000ml量瓶中，摇匀，分装于250ml三角瓶中，每瓶装90ml. 在121高压灭菌20分钟，冷却后备用。3供试品溶液的制备 以无菌操作法取检品10.0g，加入盛有90ml无菌生理盐的三角瓶中，充分振荡10分钟，制成110样品悬液。再用无菌吸管吸取110的样品悬液1ml，注入盛有9ml无菌生理盐水的试管中，充分振荡，制成1:10-2的稀释液。 按上述操作程序依次制成1：10-3、1：10-4、1：10-5、1：10-6、1：10-7等的稀释液，作为供试品溶液。4 测定方法4.1 涂布分别吸取稀释级为10-410-6的样品稀释液各0.2ml，用无菌L形玻璃棒均匀涂布于固体培养基平板上，每稀释级重复23个平板。4.2 培养 倒置，于3537厌氧培养2448小时后，计算单个菌落。5.3 计数 选取菌落数在30300个平板进行有效活菌计数，并计算同一稀释级的平均数。5 计算计数后按下式进行样品中活菌的计算：ND10植物乳杆菌数（cfu/g）= 0.2W N：平板中菌落数（同一稀释级数的平均值，cfu）； D：稀释倍数； W：取样量（g）。6结果报告上述测定的植物乳杆菌含量为每1g样品中的活菌数量。2、 乳酸菌的作用名称含量功能特点使用方法粪链球菌200亿cfu/g1、 产生乳酸、维生素、酶及抑菌物质。2、 抑制大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌的生长。3、 饲料中添加，可大量减少抗生素和酶的用量。4、 提高免疫力，提高防病抗病能力，减少消化道、呼吸道疾病 。5、 降低粪便氨氮浓度，改善养殖环境。将本品均匀混合于颗粒饲料或粉料中直接饲喂。每吨配合饲料添加料参考如下：1、 鸡、鸭、鹅：50克，全场全期使用。（1-7日龄加倍使用效果更佳）2、 猪：50克，连续使用10-15天，全程使用效果更好。断奶前后一周连续使用，按每吨100-150克添加，可有效防止断奶腹泻。嗜酸乳杆菌200亿cfu/g1、代谢产生乳酸、酶及抑菌物质。2、抑制大肠杆菌、沙门氏菌的生长，减少肠炎与腹泻。3、使消化道、呼吸道疾病减少，防病抗病能力提高。4、增强机体抗氧化能力，提高免疫力 。5、降低粪便氨氮浓度，改善养殖环境。在饮水中使用或混合于饲料中。将本品均匀混合于颗粒料或粉料中直接饲喂，每吨配合饲料添加量参考如下：1、鸡、鸭、鹅：50克，全场全期使用。（1-7日龄加倍使用效果更佳）猪：50克，连续使用10-15天，全程使用效果更好。断奶前后一周连续使用，按每吨100-150克添加，可有效防止断奶腹泻植物乳杆菌200亿cfu/g1、产生乳酸、维生素、酶及抑菌物质。2、在发酵饲料中添加，既增加饲料的风味，促进动物的食欲，又有防腐作用。3、抑制大肠杆菌、沙门氏菌的生长，减少肠炎与腹泻。4、提高免疫力，提高防病抗病能力，减少消化道、呼吸道疾病 。5、降低粪便氨氮浓度，改善养殖环境。将本品与其他益生菌混合均匀后，用于发酵饲料，每吨发酵饲料添加量参考如下：每吨发酵饲料按1公斤添加。4、 乳酸菌的生产工艺大多数乳酸菌属于兼性厌氧和异养菌，不像双歧杆菌那样要求严格厌氧条件，对营养要求也不如双歧杆菌高，许多菌可以在MRS培养基、牛乳、胡萝卜汁、番茄汁及其他蔬菜汁中良好地生长。对厌氧条件要求不高的乳酸菌，在小规模培养时可以采用静止培养或间歇搅拌的方式进行培养。1、 平板培养复壮：将在冰箱保藏的乳酸菌斜面种子采用划线的接种方法在乳酸菌平板 培养基上划线接种，于38培养12h，使乳酸菌复壮，并形成单菌落； 培养基为按下述比例的混合物：酪蛋白胨1%、葡萄糖2%、酵母浸粉0.7%、牛肉 膏0.5%、柠檬酸三铵1.5%、磷酸氢二钾0.2%、无水乙酸钠0.5%、吐温-80 0.1%、 琼脂粉2%，pH自然，121，灭菌20Min，备用。2、 制作摇瓶种子 将在平板中培养的乳酸菌菌落挑选典型的单菌落，接种到乳酸菌液体培养基中，采 用常规方法在1000ml三角瓶液体培养基上于37培养8-12h,得到乳酸菌摇瓶种子； 所述培养基为按下述比例配置的混合液：大豆蛋白胨1%、葡萄糖1%、酵母浸粉 0.7%、牛肉膏0.5%、无水乙酸钠0.6%、磷酸氢二钾0.5%、柠檬酸三铵1.5%、吐 温-80 0.5%，pH自然，115，灭菌20Min，备用。 （有条件可加入西红柿汁10%、 胡萝卜汁10%、蘑菇汁5%具体制法：将西红柿、 胡萝卜、蘑菇按照2:2:1比例加 入水中煮沸后，慢火煮20Min后 ，过滤去渣，最 后用自来水补齐所需要的溶液。）3、 生产一级种子液：按照以下配方配制一级种子培养基，经121，灭菌45Min，pH 自然，冷却到40以下，将上述步骤得到的摇瓶种子以8%（体积分数）的接种量， 接种于生产用的一级种子罐中，37培养8-12小时，原料%100mL/g1L/g1ooL/kg1KL/Kg豆粕粉(80目)0.50.5g5g0.5kg5kg鱼粉(80目)0.50.5g5g0.5kg5kg鱼蛋白胨0.50.5g5g0.5kg5kg乳糖0.20.2g2g0.2kg2kg玉米面(80目)0.50.5g5g0.5kg5kg葡萄糖11g10g1kg10kg氯化钠0.10.1g1g0.1kg1kg磷酸氢二钠0.150.15g1.5g0.15kg1.5kg增效剂0.050.05g0.5g0.05kg0.5kg消泡剂0.030.03g0.3g0.03kg0.3kg 4、二级发酵（生产发酵）：将得到的乳酸菌一级种子，以10%体积比例接种到生产发 酵培养液的发酵罐中，发酵液培养液的配方和控制条件同生产一级