人外周血白细胞DNA提取标准操作规程(SOP).doc

人外周血白细胞DNA提取标准操作规程(SOP)（血液/组织/细胞基因组提取试剂盒(DP304)）1实验原理本法采用血液/组织/细胞基因组提取试剂盒(DP304)，从全血中分离白膜层，去除其中的红细胞及蛋白质，裂解白细胞释放DNA，再通过去除DNA中的杂质使其纯化，得到高纯度的DNA原液，最后使用微量紫外可见分光光度计对DNA的浓度及纯度进行定量检测。2实验仪器2.11.5ml EP管2.2微量移液器，10L、50L、200L、1000L2.3涡旋振荡器2.4数显恒温搅拌循环水箱2.5吸附柱CB32.6收集管2.7离心机2.8涡旋振荡器2.9微量紫外可见分光光度计（Thermo NanoDrop1000）3实验试剂3.1正常人混合血液，应避免反复冻融，否则会导致提取的DNA片段较小且提取量下降。3.2红细胞裂解液（裂解红细胞）3.3缓冲液GA（轻微裂解作用，为蛋白激酶K提供反应环境），若溶液产生沉淀，使用前应在37水浴中预热10min,以溶解沉淀。3.4蛋白激酶K（裂解蛋白质）3.5缓冲液GB（裂解白细胞，释放DNA），若溶液产生沉淀，使用前应在37水浴中预热10min,以溶解沉淀。3.6无水乙醇（沉淀DNA，去除杂质）3.7缓冲液GD（去除蛋白质），使用前应按照试剂瓶标签的说明加入无水乙醇。3.8缓冲液PW（去除盐），使用前应按照试剂瓶标签的说明加入无水乙醇。3.9洗脱缓冲液TE（保存DNA）4实验步骤4.1样品的采集与保存：用装有EDTA的塑料管采集2mL静脉血，2000rpm离心5min，可见分层，分别为血浆层、白膜层、红细胞，将血浆吸出弃去，再通过点吸的方式将白膜层全部吸出，置于干净的1.5mL EP管备用。如无法及时提取DNA，则应置于-80进行保存。4.2样品预处理：4.2.1裂解红细胞：通过低速涡旋15s混匀样品，取150L样品置于干净的1.5mL EP管，加入750L红细胞裂解液，通过手摇振荡的方式进行颠倒混匀5min，然后10000rpm离心2min，吸去上清，留下白细胞沉淀。4.2.2重悬白细胞：加入200L缓冲液GA，通过手摇振荡的方式进行颠倒混匀35min，使白细胞沉淀重悬。4.2.3裂解蛋白质：加入20L蛋白激酶K，通过手摇振荡的方式进行颠倒混匀1min。4.2.4裂解白细胞，释放DNA：加入200L缓冲液GB，通过手摇振荡的方式进行颠倒混匀10min，70水浴10min。4.2.5沉淀DNA，去除杂质：加入200L无水乙醇，通过手摇振荡的方式进行颠倒混匀15s，简短离心使样品进一步混匀并去除管盖内壁的水珠。将管内所有溶液都加入吸附柱CB3中（吸附柱放入收集管中），12000rpm离心1min，倒掉废液，将吸附柱CB3放回收集管中。4.2.6去除蛋白质：向吸附柱CB3中加入500L缓冲液GD，12000rpm离心1min，倒掉废液，将吸附柱CB3放回收集管中。4.2.7去除盐类：向吸附柱CB3中加入600L缓冲液PW，12000rpm离心1min，倒掉废液，将吸附柱CB3放回收集管中。4.2.8去除盐类：重复步骤（7）。向吸附柱CB3中加入600L缓冲液PW，12000rpm离心1min，倒掉废液，将吸附柱CB3放回收集管中。4.2.9去除残存漂洗液：将吸附柱CB3放回收集管中，12000rpm离心2min，倒掉废液。将吸附柱CB3打开盖子置于室温放置10min。4.2.10洗脱DNA：将吸附柱CB3转入一个干净的1.5mL EP中，向吸附膜的中间部位悬空滴加50L洗脱缓冲液TE，室温放置5min，12000rpm离心2min，将溶液收集到1.5mL EP管中，如无法及时测定，应置于-80进行保存。4.2.11测定DNA浓度及纯度：使用微量紫外可见分光光度计进行测定，测定前通过手弹EP管底部35次的方式来使DNA溶液混匀。5实验结果分析5.1A230nm：碳水化合物和盐类最高吸收峰吸收波长。5.2A280nm：蛋白质及酚类物质最高吸收峰吸收波长。5.3A260nm：DNA/RNA最高吸收峰吸收波长。5.4260/280：比值应在1.72.0之间，低于1.7表示有蛋白质及酚类物质污染，高于2.0表示有RNA污染。5.5260/230：比值