PCR操作步骤和常见问题解决.doc

聚合酶链式反应（PCR） 聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法，为最常用的分子生物学技术之一。典型的PCR由（1）高温变性模板；（2）引物与模板退火；（3）引物沿模板延伸三步反应组成一个循环，通过多次循环反应，使目的DNA得以迅速扩增。其主要步骤是：将待扩增的模板DNA置高温下（通常为93-94）使其变性解成单链；人工合成的两个寡核苷酸引物在其合适的复性温度下分别与目的基因两侧的两条单链互补结合，两个引物在模板上结合的位置决定了扩增片段的长短；耐热的DNA聚合酶（Taq酶）在72将单核苷酸从引物的3端开始掺入，以目的基因为模板从53方向延伸，合成DNA的新互补链。 PCR能快速特异扩增任何已知目的基因或DNA片段，并能轻易在皮克（pg）水平起始DNA混合物中的目的基因扩增达到纳克、微克、毫克级的特异性DNA片段。因此，PCR技术一经问世就被迅速而广泛地用于分子生物学的各个领域。它不仅可以用于基因的分离、克隆和核苷酸序列分析，还可以用于突变体和重组体的构建，基因表达调控的研究，基因多态性的分析，遗传病和传染病的诊断，肿瘤机制的探索，法医鉴定等诸多方面。通常，PCR在分子克隆和DNA分析中有着以下多种用途：(1) 生成双链DNA中的特异序列作为探针；(2) 由少量mRNA生成 cDNA文库；(3) 从cDNA中克隆某些基因；(4) 生成大量DNA以进行序列测定；(5) 突变的分析；(6) 染色体步移；(7) RAPD、AFLP、RFLP等DNA多态性分析等。一、试剂准备1. DNA模版2对应目的基因的特异引物310PCR Buffer 42mM dNTPmix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM5Taq酶二、操作步骤 1在冰浴中，按以下次序将各成分加入一无菌0.5ml离心管中。 10PCR buffer 5 l dNTP mix （2mM） 4 l 引物1（10pM） 2 l 引物2（10pM） 2 l Taq酶 （2U/l） 1 l DNA模板（50ng-1g/l） 1 l 加ddH2O至 50 l 视PCR仪有无热盖，不加或添加石蜡油。2 调整好反应程序。将上述混合液稍加离心，立即置PCR仪上，执行扩增。一般：在93预变性3-5min，进入循环扩增阶段：93 40s 58 30s 72 60s，循环30-35次，最后在72 保温7min。3 结束反应，PCR产物放置于4待电泳检测或-20长期保存。4PCR的电泳检测：如在反应管中加有石蜡油，需用100l氯仿进行抽提反应混合液，以除去石蜡油；否则，直接取5-10l电泳检测。三、PCR反应体系的组成与反应条件的优化 PCR反应体系由反应缓冲液（10PCR Buffer）、脱氧核苷三磷酸底物（dNTPmix）、耐热DNA聚合酶（Taq酶）、寡聚核苷酸引物（Primer1，Primer2）、靶序列（DNA模板）五部分组成。各个组份都能影响PCR结果的好坏。1 反应缓冲液：一般随Taq DNA聚合酶供应。标准缓冲液含：50mM KCl，10mM Tris-HCl（pH8.3室温），1.5mM MgCl2。Mg2+的浓度对反应的特异性及产量有着显著影响。浓度过高，使反应特异性降低；浓度过低，使产物减少。在各种单核苷酸浓度为200M时，Mg2+为1.5mM较合适。若样品中含EDTA或其它螯合物，可适当增加Mg2+的浓度。在高浓度DNA及dNTP条件下进行反应时，也必须相应调节Mg2+的浓度。据经验，一般以1.5-2mM（终浓度）较好。2 dNTP ：高浓度dNTP易产生错误掺入，过高则可能不扩增；但浓度过低，将降低反应产物的产量。PCR中常用终浓度为50-400M的dNTP。四种脱氧三磷酸核苷酸的浓度应相同，如果其中任何一种的浓度明显不同于其它几种时（偏高或偏低），就会诱发聚合酶的错误掺入作用，降低合成速度，过早终止延伸反应。此外，dNTP能与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度降低。因此，dNTP的浓度直接影响到反应中起重要作用的Mg2+浓度。3 Taq DNA聚合酶酶：在100l反应体系中，一般加入2-4U的酶量，足以达到每min延伸1000-4000个核苷酸的掺入速度。酶量过多将导致产生非特异性产物。但是，不同的公司或不同批次的产品常有很大的差异，由于酶的浓度对PCR反应影响极大，因此应当作预试验或使用厂家推荐的浓度。当降低反应体积时（如20l或50l），一般酶的用量仍不小于2U，否则反应效率将降低。4 引物：引物是决定PCR结果的关键，引物设计在PCR反应中极为重要。要保证PCR反应能准确、特异、有效地对模板DNA进行扩增，通常引物设计要遵循以下几条原则： 引物的长度以15-30bp为宜，一般（G+C）的含量在45-55%，Tm值高于55Tm=4(G+C)+2(A+T)。应尽量避免数个嘌呤或嘧啶的连续排列，碱基的分布应表现出是随机的。 引物的3端不应与引物内部有互补，避免引物内部形成二级结构，两个引物在3端不应出现同源性，以免形成引物二聚体。3端末位碱基在很大程度上影响着Taq酶的延伸效率。两条引物间配对碱基数少于5个，引物自身配对若形成茎环结构，茎的碱基对数不能超过3个由于影响引物设计的因素比较多，现常常利用计算机辅助设计。 人工合成的寡聚核苷酸引物需经PAGE或离子交换HPLC进行纯化。 引物浓度不宜偏高，浓度过高有两个弊端：一是容易形成引物二聚体（primer-dimer），二是当扩增微量靶序列并且起始材料又比较粗时，容易产生非特异性产物。一般说来，用低浓度引物不仅经济，而且反应特异性也较好。一般用0.25-0.5pM/l较好。 引物一般用TE配制成较高浓度的母液（约100M），保存于-20。使用前取出其中一部分用ddH2O配制成10M或20M的工作液。5 模板：PCR对模板的要求不高，单、双链DNA均可作为PCR的样品。虽然PCR可以用极微量的样品（甚至是来自单一细胞的DNA）作为摸板，但为了保证反应的特异性，一般还宜用g水平的基因组DNA或104拷贝的待扩增片段作为起始材料。原材料可以是粗制品，某些材料甚至仅需用溶剂一步提取之后即可用于扩增，但混有任何蛋白酶、核酸酶、Taq DNA聚合酶抑制剂以及能结合DNA的蛋白，将可能干扰PCR反应。6 PCR循环加快，即相对减少变性、复性、延伸的时间，可增加产物的特异性。四、注意事项PCR反应应该在一个没有DNA污染的干净环境中进行。最好设立一个专用的PCR实验室。纯化模板所选用的方法对污染的风险有极大影响。一般而言，只要能够得到可靠的结果，纯化的方法越简单越好。所有试剂都应该没有核酸和核酸酶的污染。操作过程中均应戴手套。PCR试剂配制应使用最高质量的新鲜双蒸水，采用0.22m滤膜过滤除菌或高压灭菌。试剂都应该以大体积配制，试验一下是否满意，然后分装成仅够一次使用的量储存，从而确保实验与实验之间的连续性。试剂或样品准备过程中都要使用一次性灭菌的塑料瓶和管子，玻璃器皿应洗涤干净并高压灭菌。PCR的样品应在冰浴上化开，并且要充分混匀。RT-PCR PROTOCOL材料与方法 1材料 1.1 供试用组织(细胞)1.2 主要仪器设备1.3 主要试剂1.4 工具酶及试剂盒 2.实验方法2.1 总RNA提取2.2 RT-PCR2.3 琼脂糖凝胶电泳材料与方法1. 材料1.1 供试用动物组织/细胞1.2 主要仪器设备1.5ml离心管、0.2ml PCR管、高速离心机、510ul加样器、220ul 加样器、20200ul加样器、TAKARA PCR仪、551可见光透射仪1.3 主要试剂RNAlocker、RNAout、RNAsaver、氯仿、异丙醇、75%乙醇、琼脂糖、SYBRGREEN I染料。1.4 工具酶及试剂盒TaKaRa One Step RNA PCR Kit2. 方法2.1 RNA提取和纯化估算RNAout、组织或细胞的用量。取组织或细胞后，将剩余的组织或细胞放入RNAlocker中保存以备下次使用。将组织或细胞匀浆后，加入1.5ml离心管。加入0.2倍RNAOUT体积的氯仿，振荡混匀30秒。室温离心15000g 3分钟。将上清液转移到另一干净离心管中。在上清液中加入等体积的异丙醇,振荡器上振荡混均30秒。室温离心15000g 5分钟，RNA沉淀将在离心底的侧面形成，小心吸弃上清液。清洗：在含RNA沉淀的离心管中加入1毫升75%乙醇,振荡器上振荡混均30秒。室温离心15000g,1分钟。小心吸弃上清液。重复清洗步骤。将离心管倒置于滤纸上以干燥RNA。加DEPC水使RNA沉淀溶解，剩余的RNA沉淀使用RNAsaver溶解以备下次使用。2.2 RT-PCR2.2.1 取TaKaRa One Step RNA PCR Kit，按下列组成配制RT-PCR反应液。10One Step RNA PCR Buffer5lMgCl2(25mM)10ldNTP Mixture(10mM)5lRnase Inhibitor(40U/l)1lAMV RTase XL(5U/l)1lAMV-Optimized Taq(5U/ul)1l上游特异性引物（20M）1l下游特异性引物（20M）1lPositive Control RNA或实验样品（1g total RNA）* 1lRnase Free dH2O24lTotal50l/Sample*当目的RNA的表达数量较少时，可加至25l。同时在反应体系中相应地应叫少Rnase Free dH2O的量。2.2.2 按以下条件进行RT-PCR反应。50 30minRT反应94 2minRTase失活94 30sec3765 30sec72 110minPCR反应2530循环 当RNA为Positive Control RNA时，反应条件如下。5015minRT反应942minRTase失活9430sec6030sec721.5min2530循环2.2.3 反应结束后，取PCR反应液 (5 10 ml) 进行琼脂糖凝胶电泳，确认RT-PCR反应产物。如果此PCR产物需用于以后实验，应将PCR产物冷冻保存。Control反应时扩增片段大小为462 bp。2.3 RT-PCR产物确认电泳后，将SYBRGREEN I染色的凝胶用可见光透射仪观察结果，确认RT-PCR产物。问 题可能原因建议解决方法RT-PCR灵敏度：在琼脂糖凝胶分析中看到少量或没有RT-PCR产物RNA被降解在用来验证完整性之前先在变性胶上分析RNA使用良好的无污染技术分离RNA在将组织从动物体取出后立刻处理在100甲酰胺中储存RNA如果使用胎盘RNase抑制剂，不要加热超过45或pH超过8.0，否则抑制剂或释放所有结合的RNase。而且，在0.8mM DTT时加入RNase抑制剂，一定要存在DTT。RNA中包含逆转录抑制剂通过乙醇沉淀RNA除去抑制剂。用70（v/v）乙醇对RNA沉淀进行清洗。可以加入糖元（0.25g到0.4g/l）以帮助小量样品RNA的恢复。逆转录抑制剂包括：SDS，EDTA，甘油，焦磷酸钠，亚精胺，甲酰胺和胍盐。将对照RNA同样品混合，同对照RNA反应比较产量以检验抑制剂。多糖同RNA共沉淀使用氯化锂沉淀RNA以除去多糖。用于合成cDNA第一链合成的引物没有很好退火确定退火温度适合您的引物。对于随机六聚体，建议在反应温度保温之前先在25保温10分钟。对于基因特异性引物（GSP），可以试一下其他GSP，或换用oligo(dT)或随机六聚体确定GSP是反义序列。起始RNA量不够增加RNA量。对于50ng的RNA样品，可以在第一链cDNA合成中使用0.1g到0.5g乙酰BSA。RNA模板二级结构太多将RNA和引物在不含盐及缓冲液条件下变性/退火提高逆转录反应温度，对SuperScript可以到50，对ThermoScript可以到65。注意：不要在60时使用oligo(dT)引物，选择一个在反应温度可以退火的GSP。对于1kb的RT-PCR产物，保持反应温度65。注意：不要在高于37时使用M-MLV。如果不需要全长cDNA，在第一链反应中使用随机引物。引物或模板对残余的RNA模板敏感在PCR前用RNaseH处理。靶序列在分析的组织中不表达尝试其他靶序列或组织PCR没有起作用对两步法RT-PCR，不要在PCR步骤中使用超过1/5的逆转录反应产物PCR灵敏度：在琼脂糖凝胶分析中看到少量或没有RT-PCR产物PCR引物设计较差避免在引物3端含有互补序列。避免可以形成内部发卡结构的序列。设计Tm类似的引物。DNA含有抑制剂诸如DMSO，SDS和甲酰胺之类的试剂会抑制Taq DNA聚合酶。如果怀疑污染了抑制剂，可以使用乙醇沉淀DNA富含GC的模板对于GC含量50的模板，使用PCRx Enhancer Solution。模板浓度太低使用104拷贝的靶序列，以在25到30个循环中获得信号。镁离子浓度太低从1mM到3mM，间隔0.5mM进行一系列反应，确定对于每个模板和引物对的最佳镁离子浓度。注意：对实时定量PCR，使用3mM到5mM的镁离子浓度。退火温度太高使用表4的公式估算Tm，把退火温度设定为低于Tm 5。因为这些公式只是估算Tm值，所有真正的退火温度实际会高些或低些。PCR灵敏度：在琼脂糖凝胶分析中看到少量或没有RT-PCR产物引物浓度太低最佳引物浓度介于0.1M到0.5M之间。为了精确确定引物浓度，在260nm测量光密度，然后使用光吸收值和消光系数计算浓度。（见公式1，2）RT-PCR特异性：在琼脂糖凝胶分析中观察到非预期条带引物和模板非特异性退火在第一链合成中使用GSP，而不是随机引物或oligo(dT)。试用允许高温cDNA合成的GSP。GSP设计较差遵循用于扩增引物设计的同样原则RNA中沾染了基因组DNA使用扩增级DNase处理RNA。使用没有逆转录的对照反应检测DNA污染。形成引物二聚体设计在3端没有互补序列的引物。引物和模板非特异性退火以2到5间隔增加退火温度，减少退火时间。在开始几个循环使用较高的退火温度，然后使用较低的退火温度。使用Platinum Taq DNA进行自动热启动PCR。避免在引物3端含有2到3个dG或dC。镁离子浓度太高对于每一个模板和引物组合优化镁离子浓度。因为扩增复杂模板导致引物错误起始使用巢式PCR或递减PCR。沾染外源DNA使用抗气雾剂的吸头和UDG（见第八章）。因为二级结构导致引物结合位点无法接近对于GC含量50的模板，使用（1-3）PCRx Enhancer Solution。PCR忠实性：