手性拆分与毛细管电泳.ppt

纸色谱分离手性化合物 1951年Kotake以纸色谱分离了谷氨酸和酪氨酸的消旋体 1952年 Dalgliesh用纸色谱拆分了芳香氨基酸 并且提出了三点接触的理论概念 一对对映体被固定相手性试剂识别 至少要受到对映体和手性试剂3个位点的作用 这些作用是氢键 偶极 偶极 静电 疏水或空间作用 也称为三点识别模式 纸色谱载体是纤维素 结构中不对称空腔对于两个对映体具有选择性识别能力 不是单纯的分配技术 而是与对称的纤维素光活性有关 用该理论知道分离氨基酸取得极大成功 缺点 展开时间过长 Contractor改进 将纤维素作薄层 分离DL 色氨酸 展开时间由纸色谱的16小时缩短为1小时 三乙酰纤维素与纤维素有类似的拆分机理 目前纤维素薄层用与分离肽类及某些对映体药物 天马行空官方博客 薄层色谱分离氟比洛芬对映体 微晶三乙酰纤维素 microcrystallinecellulosetriacetateMCTA 分离药物氟比洛芬 TCL规格 20cm 20cm acetylcelluloseAC 300 10 AC 20和300 10 AC 40 或 MCTA粒度 10微米 层厚250微米 粘合剂为羧甲基纤维素钠 sodiumcarboxymethylcvellulose CMC 或硅胶60GF254 粒度15微米 的乙酰化物水溶液 乙酰纤维素CMC薄层 取CMC1克与水10毫升搅拌5分钟 再加入手性吸附剂9克和乙醇35毫升 搅拌5分钟 匀浆后立刻铺板 乙酰纤维素硅胶60GF254薄层板 硅胶60GF2543克与水15毫升 搅拌5分钟 加入手性吸附剂9克和乙醇35毫升 振摇5分钟铺板 天马行空官方博客 室温干燥 2 5小时内使用 勿于空气中久置 流动相 乙醇 水 40 60 展开时间 150分钟 检测 UV254nm 薄层中有CMC粘合剂时 拆分效能增加 三乙酰纤维素 硅胶60GF254薄层板展开时间1小时亦有好的效果 上述条件不能拆分苯氧布洛芬对映体 见右上图 可能是两者所喊手性中心在分支中位置不同所致 立体效能和疏水作用的重要作用 卡洛芬 见右下图 对映体的分离 MCTA 硅胶60GF254流动相 异丙醇 水 40 60展开时间6小时水和异丙醇有反响洗脱作用 天马行空官方博客 环糊精 cyclodextrins CD 键合相 CD是7个 D 吡喃葡萄糖以1 4 苷键环和而成 该分子的缓和空腔具有手性识别能力 能以包结的方式的方式与对映体分子形成非对映体主客复合物 从而在色谱过程中造成滞留差异 达到分离目的 Alak首次将 CD以7个原子的桥键和于硅胶表面 成功用于分离丹酰 萘取代氨基酸及二茂铁类化合物 薄层板的制备 CD是7个 D 吡喃葡萄糖以1 4 苷键环合而成 该分子的缓和空腔具有手性识别能力 能以包结的方式的方式与对映体分子形成非对映体主客复合物 从而在色谱过程中造成滞留差异 达到分离目的 Alak首次将 CD以7个原子的桥键和于硅胶表面 成功用于分离丹酰 5 二甲氨基 1 萘磺酰 萘取代氨基酸及二茂铁类化合物 薄层板的制备 取 CD键合硅胶1 5克加入50 甲醇水溶液15毫升 含粘合剂0 02克 匀浆 铺3mm薄板 5cm20cm 空气晾干 使用时75度活化15min 流动相 甲醇 三乙基醋酸铵 1 1 PH4 1 荧光检出 手性配体交换色谱固定相 该拆分法是利用手性配体与对映异构体之间形成具有不同稳定性铜复合物进行色谱分离 当手性配体为羟基取代脯氨酸衍生物 待拆分对映体为氨基酸时复合物以离子键吸附于硅胶疏水表面 手性配体一般以氨基酸衍生物制成 如将RPC18薄层板用N N 二正丙基 L 丙氨酸铜复合物的缓冲溶液处理 制成的手性薄层板成功分离了丹酰氨基酸各对对映体 以多聚L 丙氨酸酰胺铜复合物的反相手性薄层板成功分离类似氨基酸异构体 市售手性薄层板 具有浓缩区的RPC18薄层板 硅胶平均直径5微米 所用手性配体为羟脯氨酸衍生物的铜复合物 浓缩区有孔径很大 比表面很小的惰性二氧化硅组成 惰性二氧化硅无分离作用 样品点于浓缩区展开至两相之间时可以浓缩成很窄的点或带 经高效薄层色谱可以达到有效分离 天马行空官方博客 天马行空官方博客 丹酰氨基酸对映体分离实例 薄层板制备RPC18F254TCL板 5cm 20cm 和RPC18F25HPTCL 10cm 10cm 置于0 3mol L醋酸钠 乙腈 70 30 溶液中 醋酸调节PH 7 展开后 吹去溶液 再浸渍于含醋酸铜 0 3mmol L 和聚合L 苯丙酸酰胺 mmol L 的水 乙腈 10 90 溶液中至少1小时 取出 晾干备用 流动相 水 乙腈 点样 1mmoL L浓度 检出 UV360nm结果 L 异构体的Rf值较小 与吸附剂作用较大 聚合手性配体的制备和鉴定 乙二醇 二 2 3 环氧丙烷 醚 或乙二醇二缩水甘油醚etherglycoldiglycidylether 2m L 12 8mmol 和L 苯丙酸酰胺1 5g 9 1mmol 溶于3m L甲醇中 室温搅拌可以完成反应 油状产物溶解于甲醇 作为样品进行分析 色谱柱为Sio SilTSK柱 300mm 75mm 简称额波长254nm 流动相为0 1mol L磷酸缓冲溶液 PH3 5 和甲醇 9 1 流速 1mL min 酸 碱手性试剂浸渍型手性固定相 薄层板简单的用一光活性的酸 碱或其它手性试剂浸渍 亦可制成手性固定相 对映异构体分子在色谱过程中与薄层板上的手性试剂形成非对映体而分离 应用实例 L 精氨酸浸渍硅胶薄层分离布洛芬 薄层板制备 硅胶G50g加入0 5 L 精氨酸溶液100mL 匀浆铺于玻璃板 20cm 20cm 0 5mm 上 L 精氨酸pI为8 加几滴醋酸维持PH低于等电点 使氨基酸处于阳离子型 60度干燥过夜 备用 样品溶液的制备 70 乙醇为溶剂 配制1mmol L的布洛芬对映体溶液 点样量为10uL 一维和二维展开 一维展开 对映体布洛芬和 布洛芬点在同一块板上 二维展开 首先将对映体溶液点在L 精氨酸浸渍过的板上 第一次展开后 将布洛芬溶液点在前原斑点处 也可以将两种溶液点在两块板上 在同样的条件下二维展开 天马行空官方博客 展开剂 乙醇 甲醇 水 5 1 1 玻璃缸温度32度 正负2度 展开时间30min 溶剂蒸汽预饱和15min 显色 展开结束 薄层板与60度干燥5min 置于碘蒸汽中 取出 挥发碘 用稀盐酸喷洒 加热15min 放冷 用0 2 茚三酮显色 一维展开时间15min 二维展开时间20min 碘的作用是定位 有两个展开点 茚三酮指示两个点均有精氨酸存在 手性流动相拆分法 在非手性薄层板上用含有手性试剂的流动相 CMA 的TLC法进行对映异构体的拆分更方便 添加手性离子对试剂利用对映体可与流动相中的手性离子对试剂结合 形成非对映体的离子对 即可实现在非手性薄层板上分拆对映体 DIOLF254HPTCL法拆分 肾上腺素受体阻滞剂普萘洛尔和烯丙洛尔的正相TCL法 色谱条件薄层板 LichrosorbDIOLF254HPTCL10cm 10cm 流动相 二氯甲烷中有5mmol LN 苄氧基羰基 甘氨酰基 L 脯氨酸 N carbobenzoxyglycyl L prolineZGP 和0 4mmol L的乙醇胺 点样 0 5微升或1微升 展开方式 连续展开 将薄层板置于SB CD shortbedcontinuousdevelopment 室中展开 TCL板展开前先用二氯甲烷洗涤 检出方式 shimadzuCS 930双波长扫描仪 下面是普萘洛尔和烯丙洛尔及其ZGP的结构 添加 CD cyclodextrins CD作为展开系统中手性添加剂用于拆分对映体的原理与作为手性固定相原理相同 CD在甲醇或乙腈展开剂中分离丹酰氨基酸 二茂铁 烟碱及冠醚类对映体 加入尿素可以克服 CD在有机或水溶剂中溶解度小的不足 或制备亲水性的 CD 部分取代的羟乙基和羟丙基 CD 水溶性明显增大 应用实例 分离非对映体辛可宁 Cinchonine 和辛可尼丁 Cinchonidine 色谱条件 聚酰胺薄膜 7 5cm 2 5cm 流动相最佳组成 饱和 CD的乙腈溶液 1 2mol L的醋酸 二乙胺 4 1 1 PH7 8 检测 展开后晾干薄膜 喷稀硫酸 荧光灯下被检测无现蓝色荧光 天马行空官方博客 手性药物高效液相色谱拆分 间接法 手性试剂与对映体在柱前形成非对映体 然后按常规固相分离 手性衍生化试剂法chiralderivatizationreagent CDR 直接法 直接使用手性固定相 CSP 或手性流动相 CMP 分离对映体 共同点 以现代HPLC技术为基础 并引入不对称中心 手性衍生 CDR 法原理 如某些胺类不宜直接拆分 CSP上呈弱的色谱性质衍生化转变成酰胺或氨基甲酸酯后可以显著改变色谱性质 或添加某些基团 提高对映体的选择性 或提高检测效果 CDR法满足的条件 手性试剂应是光学纯 贮存稳定 衍生化时不产生消旋化 手性试剂及其衍生物在色谱条件下稳定 反应温和和定量完成 溶质分子至少有一个官能团供衍生产物在色谱分离时显高的柱效 手性衍生化试剂的种类 酰氯 磺酰氯 酸酐 氯甲酸酯 这些试剂可以与胺类 醇类药物反应生成非对映体 酰氯 磺酰氯反应性强 但是欠稳定 放置时易消旋化 醇和叔胺在合适的氢受体 在有机溶剂中反应 常用试剂有 氯甲酸薄荷醇酯 和1 9 芴基 乙基氯甲酸酯 FLEC 主要用于分离羟基酸 胺类和氨基酸 血浆中芳丙酸类消炎止痛药的分析实例用亚硫酰氯与2 苯丙酸 2 PPA 酮洛芬 Ketoprofen 和非诺洛芬 fenoprofen 的血浆样品提取物反应 然后再与R 2 苯乙胺生成酰胺 进行色谱分离 酒石酸为天然光学纯手性化合物 对烷基醇胺类化合物具有立体选择性 O O 二取代酒石酸酐在强酸 三氯乙酸 作用下与烷基醇胺药物反应获得其单衍生物 用 FLEC手性试剂自动柱前衍生HPLC法分离麻黄碱胺类手性试剂衍生化羧酸类 N 保护氨基酸类 醇类药物 异硫氰酸酯 ITC 异氰酸酯 IC 与大多数醇类 胺类 氨基酸类生成衍生物 吸附型手性固定相 CSP AbsorptionChiralstationaryphase种类多 应用广 发展快 原理 利用不同构型的对映体与固定相分子间的作用不同 造成对映体在固定相上吸附与解吸能力不同 达到分离目的 最初使用石英 羊毛 聚葡萄糖等天然物质 分离效果不佳 合成手性固定相是将手性物质引入高分子聚合物载体 硅胶上 蛋白质手性固定相 牛血清蛋白 人血中主要成分 1 酸性糖蛋白 AGP 通过氨基酸键合到硅胶微粒上 卵粘蛋白中的糖蛋白通过共价键同硅胶固定化作为手性固定相 ES OVM 蛋白固定相分离效果好 但是上样量只有1 2nmol 粉状纤维素柱可以分离氨基酸 镍复合物 儿茶素和合成的生物碱 三醋酸纤维素 微晶纤维素MCA 可以直接装柱 价廉 性能优良 分离手性药物 特别是芳香化合物 环糊精固定相具有手性识别能力 主要是大分子上含有许多手性中心 可以选择性的与对映体作用 分子中有很多空穴 可以与相应尺寸的分子性成包合物 从而导致原对映体分子在固定相中选择性的保留 冠醚 crownether 类手性固定相与环糊精类似 是本身具有手性的低聚糖 其包合物稳定性决定与离子半径与冠醚内穴大小的匹配度 合成光活性高分子聚合物聚酰胺类 聚氨酯类 聚三甲苯丁烯类 氨基酸型 手性流动相拆分法 手性流动相 chiralmobilephaseCMP 拆分法是将手性试剂添加到流动相中 与药物消旋体结合的稳定常数不同以及药物和结合物在固定相上分配的差异实现分离 类型有配体交换型手性添加剂 chiralligand exchangecomplexes 可以直接分离氨基酸 进行半微量制备性拆分 原理 手性氨基酸与金属离子形成络合物 遇到流动相药物消旋体共同形成非对映体络合物而分离 环糊精添加剂 原理 形成包合物种类 CD三类 手性离子对添加剂原理 对映体与手性离子对形成非对映体离子对而分离 高效毛细管电泳分析 电泳是带电粒子在电场作用下定向移动 高效毛细管电泳 highperformancecapillaryelectrophoresisHPCE 是以高电场为驱动力 在细内径毛细管内荷电粒子按其淌度或分配系数的不同而分离的一种技术 电泳作为分离技术是瑞典科学家Tiselius在1937年首先提出 并且创造了Tiselius电泳仪 建立了移动电场界面方法 第一次成功的从血清中分离出 1 2 球蛋白 1948年获得若贝尔化学奖 1967hjerten最先提出在高电场强度 3mm内径的毛细管中作自由溶液的区带电泳 capillaryzoneelectrophoresisCZE 1981年 用30kV的高电压获得了理论塔板数40万 m的分离效果 1984Terabe将等离子型表面活性剂胶束引入毛细管电泳缓冲溶液体系 以胶束作为分配相 使电中性物质在毛细管电泳仪上通过在水相和胶束相的分配不同而分离 胶束电动毛细管色谱 micellarelectrokineticcapillarychromatographyMECC或MEKC 此法提高了分离选择性 扩大了毛细管电泳应用范围1985年 Hjerten将传统的等电聚焦电泳方法引入毛细管内进行 提出了毛细管等电聚焦 capillaryisoelectricfocusingCIEF 使CIEF技术在蛋白质分离中成为强有力的微柱分离分析工具 达到能分辨等电点仅相差0 01PH的高分辨水平1987Cohenandkaiger发表了毛细管凝胶电泳 capillarygelelectrophoresisCGE 的研究成果 实现了蛋白质碎片CGE分离 毛细管电泳工作示意图1缓冲溶液样品 2高压电源3缓冲溶液 4毛细管5检测器6信号处理器7信号输出8毛细管恒温 毛细管电泳基本理论 电渗或电渗流的产生电渗 electroosmosis 或电渗流 electroosmosticflowEOE 是指管内溶液在外力电场作用下整体朝一个方向运动的现象 石英毛细管由于硅醇电离成硅醇负离子 使管壁表面带负电荷 为了保持电荷平衡 溶液中水合离子被吸附到表面附近 形成双电层 当毛细管两端加电压时 双电层中阳离子朝负极运动 由于离子是溶剂化的 带动了毛细管中整体溶液向负极运动 电渗流的特点电渗流特点是具有平面流型 高效液相色谱液体流型是抛物线状 电渗驱动力均匀驱动 电渗速度径向分布几乎是均匀的 电渗流的控制电渗流是毛细管电泳中的基本操作要素 为了优化分离 往往需要控制电渗流 控制最基本的方法是改变毛细管内壁表面电荷或降低缓冲溶液粘度 改变毛细管内壁表面物理状况影响被分离组分的迁移速度 因此 改变电渗流需要通过毛细管整个操作条件优化实现 焦耳热和温度梯度 焦耳热和温度梯度的产生焦耳热是电流通过电泳介质产生 大小取决于操作功率大小 与毛细管尺寸 介质电导及电场强度有关 焦耳热通过管壁向周围散逸时形成温度梯度 焦耳热和温度梯度的控制毛细管内过热的产生和可能存在温度梯度表现在分离效能随着操作电压升高而降低 电渗流或溶质的迁移时间随着操作电压升高而不成正比例增加 电流与电压不成线性关系 减少操作电压 或降低离子强度 或降低缓冲溶液浓度可以减少缓冲溶液的导电性 使操作功率降低 不符合毛细管电泳发展初衷 不利于优化分离 使用低淌度的具有大缓冲容量 低电荷的缓冲溶液是降低焦耳热的有效方法 减少毛细管内径 一般25 75微米 来降低温差会回造成检测困难 进样少和易于堵塞 用高速空气对毛细管控温足够了 功率5 7W m 迁移时间和有效淌度样品组分从进样口迁移到检测窗所需要的时间称为迁移时间 migrationtime 它等于迁移距离除以迁移速度 a tmE lL tmV a为表观淌度 l为毛细管有效长度 tm为迁移时间 E为电场强度 L为毛细管总长度 V为操作电压 毛细管有效长度是指从进样口到检测窗的长度 柱上官学检测 有效长度比总长度短5 20cm 柱后检测 有效长度等于总长度 毛细管电泳中表观淌度是电泳淌度和电渗淌度之和 a e eo当溶质组分电泳方向与电渗方向一致时 eo取正号 相反时取负号 电渗可以用中性标记物测定 如二甲基亚砜 丙酮测得其迁移时间teo eo l teoE lL teoV e a eo lL V 1 tm 1 teo 由以上三个公式可以很方便的由毛细管分离图谱计算出阳离子组分 中性溶质 阴离子组分的有效淌度 eo 分离效能和分离度 分子扩散理论与理论塔板数对于一个高斯峰 区带展宽对应峰底宽度 Wb 4 Wb为峰底宽度 为峰的标准偏差 可以用时间 长度或体积表示 沿用色谱理论塔板数来表示电泳分离效能N l 2N为分离效能 l为毛细管有效长度 理想条件 柱塞式进样 径向扩散不计 毛细管抗对流性 分离效能可以与色谱分离中分子扩散项联系 2 2Dtm 2DlL aVD为溶质分子扩散系数 L为毛细管总长度 a为淌度 V为操作电压联立两式 毛细管电泳分离效能基本表达式为 N aVl 2DL 当l L时 N aV 2D这是Jorgenson Lukacs在1981年提出的毛细管电泳分离效能经典公式 它表明使用高强度的电场可以获得高的分离效能 这是因为高电场可以缩短迁移时间 分子扩散减少 大分子如蛋白质分子扩散系数小 区带展宽小 可以获得比小粉子溶质小得多的分离效能 实际分离效能可以从电泳图谱中求出 N 5 54 W1 2 2tm为迁移时间 W1 2为半峰宽度 实际分离效能小于理论效能 因为还存在其它影响因素 分离度RsRs 2 tm2 tm1 W1 W2 其中tm2 tm1为两个组分的迁移时间 W1 W2为两个峰底宽度 毛细管电泳与色谱分离不同主要是基于高的分离效能 而不是选择性 组分电泳淌度差别小于0 05 时也可以完全分离 分离度用分离效能表示 Rs N1 2 4 2 1 2 1 2 并且用表观淌度代替 则有 Rs 1 4 21 2 V D eo 1 2分离度Rs与操作电压平方根成正比 常用分离模式 毛细管电泳是在极细的毛细管中进行电泳的技术 根据分离机理不同有多种不同分离模式 毛细管区带电泳 CZE 或自由溶液毛细管电泳 FSEC 缓冲体系 机理 自由缓冲溶液 离子淌度分离 胶束电动毛细管色谱 MECC 缓冲体系 机理 胶束 缓冲溶液 疏水性 离子性相互作用毛细管凝胶电泳 CGE 缓冲体系 机理 凝胶 缓冲溶液 分子大小和荷电数目毛细管等电聚焦 CIEF 缓冲体系 机理 两性电解质 等电点毛细管等速电泳 CITP 缓冲体系 机理 前导电解质 尾随电解质 移动界面 毛细管区带电泳 CZE 或自由溶液毛细管电泳 FSEC 毛细管区带电泳 CZE 或自由溶液毛细管电泳 FSEC 是最简单 基本 广泛应用的分离模式 毛细管中只要填充缓冲溶液就可以 CZE分离技术不需固体支持 不存在基质效应 能够分离淌度差别很小的的组分 由于电渗流存在 阴阳离子可以同时分析 中性物质随电渗流同时流出适用于所有不同淌度的荷电离子分离 从分子量使几的小分子到几十万的生物大分子 胶束电动毛细管色谱 MECC 胶束电动毛细管色谱 MECC或MEKC 是电泳技术和色谱技术巧妙结合的分离技术 是在电泳分离缓冲溶液中加入离子型表面活性剂胶束 使电中性的物质能根据其在胶束相和水相的分配系数不同而分离 是唯一能同时分离离子型和中性物质的的分离模式 MECC是基于胶束增溶和电迁移过程进行的 其分离要求有两相 一相是带电离子胶束 是不固定在毛细管中的假固定相 具有与周围缓冲溶液不同的胶束电泳淌度 mc 并且与分离溶质互相作用 胶束增溶过程 另一相是导电的水溶液相 在电场作用下 水相由电渗流驱动流向阴极 电迁移 常用的十二烷基硫酸钠 SDS 因其表面带负电荷 与电渗流流动方向相反 流向阳极 在PH 5时由于电渗流的速度大于胶束电泳速度 故胶束实际移动方向与电渗流相同 中性物质在两相之间进行分配 疏水性物质与胶束作用较强 结合到胶束中也较稳定 相对于疏水性弱的溶质迁移慢 未结合的溶质随电渗流流出 MECC实际上是用离子胶束代替CZE中简单的缓冲溶液 从而引起电泳行为和分离机理的差别 此技术比GC HPLC采用手性固定相更为方便实用 毛细管凝胶电泳 毛细管凝胶电泳 CGE 是80年代后期发展起来的主要分离模式之一 将凝胶电泳对生物大分子高效分离能力与毛细管电泳的快速 微量和定量分析相结合成为当今分离度极高的一种电泳分离技术 CZE中的分离主要依靠荷电离粒子荷质比不同分离 凝胶电泳依赖于净电荷和粒子大小两个因素 荷电粒子在凝胶网络中穿过 粒子越大 阻碍作用越大 没有凝胶网络的筛分作用 那些荷质比不随分子大小而变的DNA SDS 蛋白质复合物就不能分离 并且可以通过添加手性时机 离子对时机 漯河时机改变分离选择性 毛细管等电聚焦 CIEF 毛细管等电聚焦 CIEF 是指在毛细管中等电聚焦 由于毛细管的抗对流性 CIEF可以在自由溶液中进行 也可以在凝胶中进行 CIEF不但具有传统的等电聚焦特点 还有毛细管电泳的高效 快速 微量和柱上检测特点 CIEF原理是根据蛋白质pI不同而进行分离 用两性电解质混合物作为载体电解质 当在用溶质和两性电解质化合液充满的毛细管两端加上电场时 pI 两性电解质化合物溶液pH值的的溶质和两性电解质带正电 向负极移动 pI 两性电解质化合物溶液pH值的的溶质和两性电解质带负电 向正极移动 当迁移至pI pH时 不带电荷 停止移动 因此不同等电点的两性电解质在电场中从阳极到阴极按pH逐渐增加的顺序排列 从而形成稳定的pH梯度 梯度中每一处pH取决于该处两性电解质的pI值 同样 蛋白质由于等电点不同而分离 一旦聚焦达到稳定 电解质不再移动 电流为零 聚焦完成 溶质和两性电解质被移动 区带通过检测窗被检测 聚焦完毕的区带通过在一端施加压力或在一个电极槽中加盐类完成 毛细管等速电泳 CITP 毛细管等速电泳 CITP 是一种界面移动电泳技术 在CITP中使用两个缓冲溶液体系 建立一个所有区带以相同速度移动的状态 两个缓冲溶液称为前导电解质和尾随电解质 样品加在两个体系交界处 一次CITP试验只能分离正离子或负离子 不能同时分离两种离子 在CITP中各种离子以独立的区带移动 但是移动速率相等 等于前导离子移动的速度 如果任意相邻两个区带正或负离子移动速率不一样 必然导致区带之间脱开 使脱开区缺少正或负离子 这是电中性所不允许的 在分离过程中场强会自动调整 以维持该区带的等速移动 迁移速率 淌度 场强 淌度大的区带场强较低 这种现象使各区带间保持明显的界面 如果一个离子扩散到相邻区带 由于场强发生变化 速率改变 又使它回到原来区带 CITP的另一个特征是在一个区带内 溶质的浓度保持恒定 这取决于前导离子的浓度 CITP通常是恒流操作 在每一区带内离子浓度与其淌度之比需保持恒定 离子浓度低于前导离子浓度的区带会被压缩 高于前导离子浓度的区带回被扩展 以调整至一个合适的浓度 CITP的溶质浓度原理用于CZE MECC和CGE的柱前浓缩 毛细管操作步骤 毛细管操作步骤包括 进样 分离 检测和数据处理1 将运行缓冲溶液充满毛细管柱 2 移去进样端的缓冲溶液 用样品池代替 3 用电动或压力进样方式进样 4 将进样端缓冲溶液放回 5 毛细管两端加操作电压进行电泳分离 6 被分离样品迁移至检测窗口检测 数据纪录和处理 毛细管的进技术 毛细管的内径限制了毛细管的进样技术 一般职能用电动方式或流体动力学方式进样 电迁移进样电迁移进样也叫电动进样 毛细管进样端首先置于样品池中 并且在很短的时间内施加进样电压 使样品通过电迁移方式进入毛细管 进样电压通常为操作电压的1 5 1 3 进样时样品组分同时受电泳和电渗作用 实际进样量与分析组分的表观淌度有关 进样量 Q linj r2Cl为样品区带长度 r为毛细管内径 C为样品浓度 样品区带长度由进样时间内电泳速度和电渗速度确定 linj ti ve veo ve ueEi ueVi Lveo ueoEi ueoVi LVi为进样电压 L为毛细管总长度 ue为电泳淌度 ueo为电渗淌度 Q ti ue ueo r2CVi L由上式可知 电迁移进样时改变进样电压和进样时间可以控制进样量 电迁移进样中存在一种歧视现象 电泳淌度大的组分进样量大 电泳淌度小的组分进样量少 流体动力学进样 流体动力学进样是最广泛的进样方式 可以通过以下几种方式来实现 在进样端加气压 在毛细管出口端抽真空 调节进样端样品池和出口端缓冲溶液池高度使之产生虹吸作用 流体动力学方式进样量基本不受样品基质影响 Q ti P r4C 8 L即流体动力学进样量受进样时间 压强差 毛细管内径 样品浓度和缓冲溶液粘度影响 高度差 虹吸 进样 P g hQ ti g h r4C 8 L即进样量受进样时间 高度差 缓冲溶液的密度 毛细管内径 样品浓度和缓冲溶液粘度影响 虹吸进样一般是没有压力进样功能的系统采用 将样品池抬高5 10cm 进样10 30mins即可 分离系统 毛细管电泳仪中的分离硬件是毛细管电泳柱 毛细管恒温系统 直流高压电源和电极 缓冲液池 毛细管的选择 核心部件是毛细管电泳柱 理想的材料是具备化学惰性和电惰性 紫外可见光透性 柔韧性 强度高 耐用且便宜 目前有熔融石英 聚四氟乙烯 Teflon 玻璃等 石英管的外表涂上一层聚酰亚胺保护层 外壁保护层去掉一小段作为检测窗 聚四氟乙烯可以透过紫外线 不需要特殊检测窗 细内径的应用有助于高电场下减少电流 降低焦耳热 增大散热面积 加快散热速度 使在电泳过程中大大降低管心和管壁温差 减少粘度和速度径向分布差异 保持电渗流流型扁平性 柱塞流 实现毛细管电泳高效分离 内径过小造成进样 检测 清洗等技术困难 毛细管的理论塔板数和长度 内径一般25 100微米 毛细管的理论塔板数随着长度增加而增加 为了恒定场强 增加柱长必须增加操作电压 同时还会延长分析时间 实际上限制了毛细管的无限加长 有效长度从10cm的凝胶柱到80 100cm用于分离复杂样品的熔融石英毛细管空柱 常用30 75cm 一般用碱性溶液冲洗毛细管内壁吸附层 使表面的硅醇去质子化 为使用过的为涂渍的毛细管柱 一般用1N的氢氧化钠 5 15倍柱体积 洗 再用0 1N氢氧化钠 5 15倍柱体积 洗 然后用3 5倍缓冲溶液洗 一系列清洗过后 用缓冲溶液运行1 2小时 每次分析样品之前宜用0 1N氢氧化钠和运行缓冲溶液清洗毛细管 也可以用强酸 1N盐酸 和有机溶剂 甲醇 乙醇 清洗 涂渍柱不可用碱性溶液洗 使用一段是后重现性变差 可以用0 1N盐酸 有机溶剂 和0 1M磷酸 PH2 5 清洗 毛细管恒温系统和高压电源 温度有效控制很重要 温度变化1度 缓冲溶液粘度变化2 3 粘度对进样和迁移时间影响很大 因此毛细管的温度控制在正负0 1度 河南高温系统采用告诉气流或液体浴恒温 高压电源 常用0 30kV 电流200 300 A 为了获得迁移时间的高度重现性 一般控制电压稳定在正负0 1 高压电源应该可以切换极性 正常毛细管电泳分离 电渗流总是从正到负 酒药正极端进样 负极端检测 但是电渗流被减弱 反转或用了凝胶柱 则要把电极极性反转 负极进样正极检测 由于进口端和出口端受到监测器结构限制 只能由电源切换转换极性 使用双极性电极可以由软件控制直接切换电极 电极和缓冲溶液池 毛细管电泳系统中 由正负铂电极 进样缓冲溶液池 检测端缓冲溶液池和充满运行的缓冲溶液管组成一个导电回路 电极 化学惰性的铂电极 缓冲溶液池 特制的玻璃瓶和聚四氟乙烯小离心管 缓冲溶液池的液面高度控制保证毛细管分离效率和迁移时间重现性的重要因素 由于缓冲溶液池本身存在着容积的系统误差 50 L缓冲溶液必然造成两池液面无法持平 试验结果表明50 m内径的毛细管有2mm的高度差可以带来迁移时间2 3 误差 100 m内径的毛细管有2mm的高度差可以带来迁移时间10 的误差 更新缓冲溶液可以提高电泳分离重现性 溶液电解会改变缓冲溶液PH值 电渗流也随之改变 水溶液中电解会在正极产生氢离子 负极产生氢氧根离子 伴随着离子迁移 称为缓冲损耗 电解程度取决于电流大小 PH值变化取决于缓冲溶液的缓冲容量 检测方法 毛细管内径小 检测信号是突出问题 分析只需要nL级样品量 但是不是痕量分析技术 它需要相对较浓的样品组分 或是采用预浓缩方法 以提高检测区带浓度 紫外 可见光是毛细管电泳中最广泛的检测方法 紫外 可见光检测 可以使熔融石英管可以在200nm以上到可见光范围内检测 柱上检测没有死体积和组分混合而产生的饿谱带展宽 因为检测窗口开在毛细管上 检测区的宽度小于区带宽度 毛细管的电泳峰宽一般2 5mm宽 专门设计的检测窗狭缝就为此宽度 灵敏度 A bc 取决于光程b 浓度c和吸收系数 泡状池可以增大光程而不减少分离效率和分离度 较低的紫外波长可以获得较高的灵敏度 如多肽和糖 完全可以在200nm或200nm以下检测 需用背景吸收小的磷酸盐或硼酸盐缓冲溶液 线性检测范围朗伯 比尔定律中仪器偏差是定量分析的根本限制 分析物浓度较高时表现为校正曲线斜率较小 线性检测范围主要决定于到达监测器的杂散光 理想的情况是所有光都经过毛细管轴而不经过管壁 由于毛细管体积小及曲率原因 毛细管检测线性范围比液相色谱的要小 增大狭缝可以增加二极管受光量 提高检测限