sop微生物检查操作规程.doc

颁发部门 微生物限度检查操作规程接收部门生效日期操作标准-质量制定人制定日期文件编号 审核人审核日期文件页数共6页批准人批准日期分发部门 1目的 建立微生物限度检查的标准操作规程，确保检验结果的准确性。2 范围 适用于本厂质监科化验室对本厂生产的固体制剂及物料进行微生物限度的检查。3 责任 化验员有责任按照本操作规程进行检验、判定,并对检验结果负责。4 定义 微生物限度检查法系指非规定灭菌制剂及其原、辅料受到微生物污染程度的一种检查方法，包括染菌量及控制菌的检查。5 内容5.1 总则：5.1.1 供试品应随机抽样。一般抽样量为检验用量（2个以上最小包装单位）的3倍量。5.1.2 供试品在检查前不得开启，检查全过程均应严格遵守无菌操作规程，严防再污染。5.1.3 控制菌的污染检查应做相应的已知菌对照试验，对照菌株为大肠杆菌CMCC（B）44102，每批试验已知菌加入量为50-100个。5.1.4 染菌量的检查或控制菌的检查均应做空白对照试验。5.1.5 供试品稀释成稀释液后应在均匀状态下取样，凡有抑菌成份或防腐剂的供试品应做特殊处理后进行检验。5.1.6 供试品稀释后应在1小时内操作完毕。 第2页/共6页5.1.7 除另有规定外，细菌培养温度为30-35，霉菌、酵母菌培养温度为25-28，控制菌培养温度为361。5.1.8细菌、霉菌检验结果的报告以1g、1ml或10cm2为单位；控制菌检验报告以每1g、每1ml或每10cm2为单位报告“检出”或“未检出”。5.2仪器、用具 恒温培养箱、隔水式生化培养箱、电子天平，移液管(1ml、10ml)、试管、离心管、双碟、镊子、剪刀、不锈钢吸管筒、酒精灯、取样勺、称量纸、研钵一个、不锈钢双碟筒。5.2.1用具的包扎 移液管：用纱布包住移液管，然后放入不锈钢灭菌筒内。 试管、双碟：试管在管口塞上纱布棉塞、双碟放入不锈钢双碟筒内。 无菌衣、裤、帽、口罩：用布口袋将洗净的衣裤、帽子、口罩配套后装入，扎紧袋口，再用牛皮纸包好。5.2.2用具的灭菌 将包扎好的用具，在1210.5 蒸汽灭菌柜中灭菌30 分钟，物品取出时切勿立即置冷处，以免急速冷却灭菌物品内蒸汽凝造成负压，易致染菌，应置烘箱烘干。5.3培养基、试剂5.3.1营养琼脂培养基 称取本品36克，加1升蒸馏水，加热溶解后，按需要进行分装，经12115分钟灭菌备用。5.3.2虎红培养基 称本品30克，加1升蒸馏水，加热溶解，分装，高压灭菌11620分钟。5.3.3胆盐乳糖培养菌（BL） 称本品36克，加1升蒸馏水，加热溶解，分装，高压灭菌11620分钟。5.3.4曙红亚甲蓝琼脂培养基（EMB） 称本品42克，加1升蒸馏水，加热溶解，分装，高压灭菌11620分钟。5.3.5生理盐水 称取9 g 氯化钠，加水1000 ml 溶解，分装后于1210.5湿热灭菌30分钟，供作稀释剂用。5.3.6 75%酒精棉 量取无水乙醇75ml，加水稀释至100ml，摇匀，将脱脂棉与75%酒精混合即得。5.3.7 0.1%新洁而灭 第3页/共6页 量取5%新洁而灭20ml，加水稀释至约1000ml，摇匀，即得。5.4进入无菌室的操作要点 用肥皂水洗手，换消毒鞋，关闭缓冲间紫外灯，将用具物品搬入传递窗口内，用紫外灯灭菌15分钟，关闭第一层门，用1%新洁而灭洗涤双手，用消毒毛巾擦干，换上无菌衣、裤、帽子、口罩及消毒鞋。关闭无菌室内紫外灯，进入第二层门并将用具搬至无菌室内，关闭无菌室门。 凡进入无菌室后不应再外出取物品，因此，在每次试验中所用物品必须计划好，并准备好备用物品。从进入第一层门直至无菌室内，随工作人员的进入就喷雾0.1%新洁而灭溶液。5.5检查法：5.5.1 细菌、霉菌的染菌量，采用培养皿菌落计数法。5.5.1.1 供试液的制备： 固体供试品以无菌操作称取10g，置含0.9%氯化钠的生理盐水100ml中，振摇溶解，使成1:10稀释度的供试液。然后吸取1:10的供试液1ml，置含0.9%氯化钠的生理盐水9ml中，稀释成1:100稀释度的供试液。依次可制成1:1000的供试液。5.5.1.2 吸样： 分别吸取1:10、1:100、1:1000的供试液1ml分别注入2-3个平皿中。5.5.1.3 注皿： 将事先融化并置45水浴中保温备用的细菌、霉菌培养基分别倾注入平皿，每皿约15ml，随即转动平面，使供试液与培养基混匀，分别作上标记，置水平台上待凝。同时作空白对照（不加样品，将两个双碟分别加入虎红培养基和营养琼脂培养基，操作同上）。5.5.1.4 培养： 将凝固好的平皿按规定温度倒置于培养箱中培养。细菌培养48小时；霉菌培养72小时。5.5.1.5菌落形态 细菌菌落是一个菌细胞或菌细胞团在局限位置上，经一定条件下繁殖成肉眼可见的细菌群体，外观湿润或干燥，表面光滑或折皱，外缘整齐或缺陷。 具有放射或树枝样分枝的菌丝是霉菌菌落的特征。初形成时多无色透明，有明显的折光性，成熟的霉菌菌落有各种颜色的孢子形成。在较暗的背景下以透射光观察，易于识别。5.5.1.6菌落计数法： 先用肉眼观察，标记并计数，然后用5-10倍放大镜检查有无遗漏。 第4页/共6页 如有片状菌落或花斑样菌落蔓延生长的以及平板受到污染的情况，则该平板计数无效。若平板上有2个或者2个以上的菌落重叠，如可分辩，仍以2个或是2个以上菌落计数。当一个稀释级用2个平板时，应采用2个平板菌落数的平均值。计算各稀释级的平均菌落数按菌数报告规则报告菌数。 如各稀释级平板均无菌落生长，或仅最低稀释级平均菌落数小于1时，则报告菌数为小于10个。 菌数报告规则： 细菌宜选取平均菌落数在30300之间的稀释级，霉菌宜选取平均菌落数在30100之间的稀释级作为报告菌数计算的依据。如有1个稀释级在30300（30100）之间时，将该稀释级的菌落数乘以稀释倍数报告；如同时有2个稀释级在30300（30100）之间时，按下式计算两级比值。 高稀释级的平均菌落数稀释倍数 比值 = 低稀释级的平均菌落数稀释倍数 当比值2时，以两稀释级的均值报告，当比值2时，以低稀释级的平均菌落数乘以稀释倍数报告；如同时有3个稀释级的平均菌落数均在30300之间时，以后2个稀释级计算级间比值报告；如各稀释级的平均菌落数均不在30300以最接近30或300的稀释级平均菌落数乘以稀释倍数报告；如各稀释级平均菌落数均在300（100）以上，按最高稀释级平均菌落数乘以稀释倍数报告；如各稀释级平均菌落数均小于30时，一般按最低稀释级平均菌落数乘以稀释倍数报告。5.5.2 控制菌的检查： 除另有规定外，取供试液10ml（相当于供试品1g、1ml、10cm2），直接或处理后接种，经增菌、分离培养后，进行革兰染色、生化试验与血清凝集试验等项检查。5.5.2.1大肠杆菌检查法： 取胆盐乳糖培养基3份，每份100ml，2份分别加入规定量的供试液，其中1份加入对照菌50-100个作阳性对照，第3份加入与供试液等量的稀释液作阴性对照。培养18-24小时（必要时可延至48小时）。阴性对照应无菌生长。取上述3份的培养物各0.2ml，分别接种至5mlMUG培养基管内培养，分别于5小时与24小时时，取未接种的MUG培养基管作本底对照，将各管置365nm紫外光下观察。阳性对照管呈现荧光，MUG阳性。供试液的MUG管呈现荧光，MUG阳性；无荧光，MUG阴性。然后加数滴靛基质试液于MUG管内，液面呈玫瑰红色为阳性，呈试剂本色为阴性。 当阴性对照呈阴性，阳性对照正常生长，供试液胆盐乳糖培养基培养液澄 第5页/共6页明，并证明无菌生长，判未检出大肠杆菌。 如MUG阳性、靛基质阴性，或MUG阴性、靛基质阳性，均应取供试液胆盐乳糖培养基培养物划线于曙红亚甲蓝（EMB）琼脂平板或麦康凯琼脂平板，培养18-24小时，如上述供试液培养物的分离平板无菌落生长，判未检出大肠杆菌。或有菌落生长，应挑选2-3个可疑菌落按照药典规定作生化试验及革兰染色、镜检，并按规定判断结果。5.5.2.2大肠杆菌菌落形态 在EBM琼脂平板上的典型菌落呈紫黑色或中心深紫色，圆形，稍凸起，边缘整齐，表面光滑，带有金属光泽。 非典型形态，在EBM琼脂平板上呈浅紫、粉紫、粉色，无明显的暗色中心，应做为疑似菌进行鉴定。5.5.3对照试验：5.5.3.1阴性对照试验：检验试验全过程无菌技术的可靠性。5.5.3.1.1 菌数测定阴性对照试验 分别吸取生理盐水1ml置于无菌平皿中，分别按细菌、霉菌测定方法注皿、培养，不得长菌。5.5.3.1.2 控制菌检查阴性对照试验 吸取生理盐水于增菌液中，按控制菌检查方法检查不得长菌。5.5.3.2 阳性对照试验：检查供试品是否对控制菌生长产生干扰作用及检查培养条件是否适宜。5.5.3.2.1 方法：于供试液中加入一定量的相应对照菌，做平行试验。5.5.3.2.2 规定阳性对照菌株为大肠杆菌CMCC（B）44102。对照菌的加入量为50-100个，可事先预试确定。5.5.3.2.3 用计数方法，取37培养18-20小时的新鲜肉汤培养物，以10倍递增稀释至10-6,取其0.1ml于普通肉汤琼脂板表面涂抹进行测定。5.5.3.2.4 当供试品未检出菌时，而阳性对照试验也未能检出，则不能做出供试品未检出控制菌的结论。5.5.3.2.5 阳性对照试验操作必须与供试品检验操作严格分开，避免交叉污染。5.6复试：5.6.1 菌数测定不合格者应复试，控制菌检验以一次检验为准，不再复试，但应保留检出菌株一个月备查。5.6.2 复试项目以不合格项目为准，做单项复试。5.6.3 复试需取同批样品测定2次。5.6.4 复试报告以3次测定结果的算术平均值报告。 第6页/共6页5.7 检验报告：5.7.1 测定菌数报告：以各次测定结果的全部平均值报告。5.7.2 控制菌以一次检验的结果报告：报告为检出或未检出控制菌。6 培训6.1 培训对象：化验员。6.2 培训时间：二小时。7 记录 记录名称 保存部门 保存时间 微生物限度检验记录 质监科 药品有效期后一年 QF-01-006-00微 生 物 限 度 检 验 记 录品 名： 批 号： 规 格： 检验日期： 年 月 日细菌计数 3035 48h稀释倍数