中药炮制实验设计.doc

中药炮制实验设计实验题目：甘草砂炒法炮制僵蚕的可行性研究系 部：药学院专 业：班 级：姓 名：学 号：指导老师：研究时间：2012年4月1日至4 月17日前 言僵蚕Bombyx batryticatus是蚕蛾科Bombycidae昆虫家蚕B.mori L.的幼虫感染白僵菌Beauxeria bassiana(Bals.)Vuill.而僵死的干燥全虫1。本品原名白僵蚕，始载于神农本草经2,列为中品。僵蚕味咸辛，性平。具有退热、止咳、化痰、镇静、镇惊、消肿等功效。用于治疗癫痫、高热惊厥、流行性腮腺炎、上呼吸道感染、遗尿等症1。僵蚕的药用历史非常悠久,临床疗效确切，但是本品生用气味不良，不利于患者服用，自古以来僵蚕的炮制方法就多种多样，并且每一种炮制方法都极富意义和特色。而2010年中国药典规定僵蚕的炮制方法为：麸炒和清炒。药物与麦麸拌炒的方法称为麸炒。麸炒僵蚕目的的主要使药物矫味矫臭、利于服用。在实践中，发现利用麦麸作为辅料有诸多缺点。如：麦麸是一种易燃物给加工带来不安全因素；麦麸质轻而易附在药材表面，炒后不易完全筛去，二者都会给操作带来不便。再者，麦麸极易炒黑，价格也较高，用量较大，因而不太经济3。因此,笔者探索利用甘草煎液砂炒代替麸炒,利用河砂的传热快、温度高、能紧密接触药物，使整体受热均匀的特点，而达到使僵蚕矫臭、改良的目的,而又利用甘草的清热解毒、祛痰止咳、缓和药性等功效来增加僵蚕的止咳化痰等功效。笔者采用薄层色谱法对僵蚕三种炮制品进行薄层鉴别研究；采用高效液相色谱法测定各种炮制品中草酸铵、槲皮素和山奈酚的含量。希望通过此次实验，探索甘草砂炒法炮制僵蚕是否可行。摸索出更适应中药临床疗效和大量生产的炮制方法。甘草砂炒法炮制僵蚕的可行性研究李莹辉 河南中医学院药学院 2011129009 河南 郑州 450000摘要：目的：比较甘草砂炒法炮制与不同炮制方法炮制僵蚕主要成分之间的关系。方法:薄层色谱法对僵蚕三种炮制品进行薄层鉴别研究；采用高效液相色谱法测定各种炮制品中草酸铵、槲皮素和山奈酚的含量。结果预测：僵蚕各炮制品的薄层色谱未见明显差异，但僵蚕经过炮制后体内草酸铵含量都有不同程度的下降，其中甘草砂炒僵蚕的含量最低，而清炒僵蚕中草酸铵含量下降的最少。僵蚕经过炮制后所含槲皮素与山奈酚的含量变化不大，与生品较为接近，但麸炒僵蚕与甘草砂炒僵蚕中槲皮素与山奈酚的含量降低得较为明显。期望结论：甘草砂炒法和麸炒法对僵蚕中草酸铵、槲皮素和山奈酚的含量分布影响不大，甘草砂炒法可替代麸炒法。关键词：僵蚕;炮制;薄层色谱法;高效液相色谱法;含量测定 僵蚕Bombyx batryticatus是蚕蛾科Bombyciade昆虫家蚕B.mori L.的幼虫感染白僵菌Beauxeria bassiana(Bals.)Vuill.而僵死的干燥全虫1。本品原名白僵蚕，始载于神农本草经2,列为中品。僵蚕味咸辛，性平。具有退热、止咳、化痰、镇静、镇惊、消肿等功效。用于治疗癫痫、高热惊厥、流行性腮腺炎、上呼吸道感染、遗尿等症1。虫体表面的白粉中含有草酸铵，是僵蚕抗惊厥的有效成分4。僵蚕破碎后可分为皮类、透明胶状物和绿褐色物质等不同部位，其中绿褐色物质为蚕食用桑叶未经消化就僵死后贮存于体内的聚合固合物，具有玻璃样光泽。由于桑叶富含黄酮类化合物，所以有文献报道，僵蚕体内含有一定量的槲皮素和山奈酚5。因此，结合临床应用和生产实践对僵蚕的新炮制工艺进行研究。本文以僵蚕中草酸铵、槲皮素和山奈酚为考察指标，对甘草砂炒法和清炒法、麸炒法炮制的僵蚕进行了薄层色谱对比研究，采用高效液相色谱法对炮制品中草酸铵、槲皮素和山奈酚进行了含量测定研究，以探明甘草砂炒法与传统炮制方法的优劣。1 仪器与试药61.1 仪器戴安 UltiMate 3000 高效液相色谱仪，UltiMate 3000 四元泵，UltiMate 3000 variable wavelength 检测器，Chameleon 工作站，KQ-25B型超声波清洗器（昆山超声仪器设备公司），河北红日天然气灶，圆底炒锅，TES-1306热电偶数字温度计，JYZ-6D型九阳榨汁机，PHSJ 4A 型酸度计( 上海雷磁) ，TDL 5 速离心机 。 1.2 试药槲皮素 (100081200406) 和山奈酚标准品(110861200808) 均购置于中国药品生物制品检定所。硅胶G（青岛海洋化工厂），氯仿、甲醇、乙醇、浓氨水、草酸铵、磷酸氢二铵、磷酸、氯化钙等试剂均为分析纯（天津化学试剂），自制重蒸水。僵蚕、甘草购于河北安国昌达中药饮片厂（20081123），经本院中药鉴定教研室王红霞老师鉴定系蚕蛾科昆虫家蚕 Bombyx mori L. 幼虫感染或人工接种白僵菌 Beauxeria bassiana ( Bals. ) Vuill 而致死的干燥虫体和豆科植物甘草Glycyrriza uralensis Fisch. 的干燥根及根茎。 2 方法与结果2.1 僵蚕不同炮制品的制备2.1.1清炒僵蚕 取净僵蚕300g,置炒制容器内，中火加热，不断翻炒至虫体表面微微鼓起，表面略挂火斑，颜色加深时取出， 放凉。2.1.2 麸炒僵蚕 先将炒制容器用中火加热至所需程度，均匀撒入定量的麦麸，即刻烟起，随之投入净僵蚕300g，不断翻炒至僵蚕表面呈黄色，麦麸呈黑色时，取出，筛去麦麸，晾凉。 2.1.3甘草砂炒僵蚕 取甘草30g煎汤浓缩定容至30mL，取河砂筛去石子和极细者，用清水洗净泥土，干燥后置于热锅内，加入甘草汤液，中火拌炒均匀，至有浓厚的蒸气时，投入净僵蚕300g，不断翻炒至僵蚕表面呈金黄色，取出，筛去砂子，放凉。河砂用量以能掩盖所加药材为度。表1：僵蚕不同炮制方法炮制前后得率炮制品种炒前炒后得率清炒僵蚕 300g 麸炒僵蚕300g甘草砂炒僵蚕300g2.2 僵蚕不同炮制品薄层色谱鉴别2.2.1 色谱条件 层析板:取硅胶G ,加5%羧甲基纤维素钠,研匀, 铺板,干燥,105活化1h。2.2.2 药材溶液的制备 分别取各种僵蚕粗粉各1g，置 50mL 具塞三角烧瓶中，加甲醇10mL,超声提取30min,滤过,滤液浓缩至2mL,作为对照药材溶液。2.2.3僵蚕各炮制品薄层鉴别方法17 取上述各种药材溶液各 10L点于同一薄层板上，以氯仿-甲醇（12:1）为展开剂上行展开，展距16-18cm,取出晾干,在365nm紫外灯下检视,结果如图1所示。 2.2.4 僵蚕各炮制品薄层鉴别方法 28 取上述各种药材溶液各 10L点于同一薄层板上,以石油醚一丙酮(7:3)为展开剂上行展开,展距15-17cm,取出晾干，碘蒸气显色，结果如图2所示。2.2.5 僵蚕各炮制品薄层鉴别方法39 取上述各种药材溶液各10L点于同一薄层板上，以丙酮-苯-70%乙醇-浓氨水（5:4:2:1）为展开剂上行展开，展距15-17cm取出晾干，在365nm紫外灯下检视，结果如图3所示。 图1图2 图3 预测：从僵蚕生品、清炒品、麸炒品和甘草砂炒品的薄层色谱层析图来看，三种炮制品中草酸铵、槲皮素和山奈酚成分基本一致，与生品比较仅存在含量的差异。2.3各种炮制品中草酸铵的含量测定92.3.1色谱条件 色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶(Diamonsil，250mm 4.6mm，5m);流动相为磷酸氢二铵水溶液( 5.0g/ L，pH2.50); 流速为0.5mL/ min；柱温为25；检测波长为214nm;进样量为20L，在该色谱条件下草酸铵分离效果良好，色谱图见图4 和图5。图4 草酸铵标准品HPLC图 2.3.2 标准品溶液的制备 精密称取室温空气干燥至恒重的草酸铵约0.16g，平行3份，按药典方法用KMnO4标准溶液(0.0211mol / L)测定的草酸铵含量为99.39%(RSD为0.79%)。再精密称取以上干燥至恒重的草酸铵0.1506g,用流动相溶解，定容至100mL摇匀,用0.45m的微孔滤膜抽滤,滤液即为储备对照液(1. 506mg/mL草酸铵溶液)。图5 僵蚕样品中草酸铵 HPLC 图2.3.3 供试品溶液的制备 取僵蚕干燥粉末(过20目筛)10.00g,用8倍量和5倍量水,分别于沸水浴上回流,30min/次,抽滤,合并 滤液,用容量瓶定容为200mL。再从中精密吸取1mL于10mL试管 中,在70-80水浴上加热5min,滴加CaCl2 试液 (0.25mol/L) ,使CaC2O4沉淀完全,放冷,离心,弃去上清液,沉淀用流动相溶液超声溶解,定量转移于50mL,容量瓶中定容，用0.45m的微孔滤膜抽滤,即为供试品溶液。2.3.4 标准曲线的制备 分别精密吸取储备对照液0.5 、1.0、2.0 、3.0 、4.0mL于10mL容量瓶中，用流动相稀释，定容，摇匀，制成75.3、150.6 、301.2 、451.8、602.4g/mL的系列对照品溶液，用0.45m的微孔滤膜滤过，取20L 注入色谱仪，记录峰面积。以标准品浓度（x）对峰面积（y）进行线性回归,得一元回归方程为:y= ax +b ( r = )。结果表明草酸铵 在 g/ mL 浓度范围内与峰面积呈良好的线性关系。 2.3.5 精密度实验 取一定浓度的标准品溶液，重复进样5次，每次20L，记录峰面积，计算RSD为 。2.3.6 稳定性实验 取供试品溶液于室温放置，分别于0、2、4、8、24h进样20L，记录峰面积，计算RSD 。2.3.7 加样回收率实验 取僵蚕干燥粉末（过20目筛）10.00g，精密量取草酸铵约0.4g，加入其中，按“2.4.3”项下方法，除供试品溶液再稀释1被外（即制备成100mL）,同法操作制备供试品溶液，取其20L进样，记录峰面积，求得加样回收率为 ，RSD为 。2.3.8 样品测定 分别精密称取各种样品，按“2.3.3”项下方法,制成供试品溶液，注入高效液相色谱仪进行测定，记录草酸铵的峰面积，计算含量，结果见表2。表2 各种僵蚕炮制品草酸铵含量测定结果表炮制品种样品重量（g）峰面积相对浓度（mg/mL）草酸铵含量（%）生品僵蚕清炒僵蚕麸炒僵蚕甘草砂炒僵蚕2. 4 僵蚕各炮制品中槲皮素与山奈酚的含量测定2.4.1 色谱条件 色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶 ( Diamonsil，250mm 4.6mm，5m) ; 流动相为甲醇0.4%磷酸(55:45);流速为1mL/min;柱温为30;检测波长为 370nm ;进样量为20L。在该色谱条件下槲皮素与山奈酚的分离效果良好。其中槲皮素的保留时间为 ，而山奈酚的保留时间 为 。色谱图见图 6 和图 7 。 2.4.2 标准品溶液的制备 分别精密量取浓度为 0.214mg/ mL 的槲皮素标准品溶液 2.0mL和浓度为0.892mg/mL的山奈酚标准品溶液1. 0mL 至 25mL 量 瓶中，用甲醇定容，摇匀，即得混合对照品溶液，其中槲皮素的浓度为17.12g/mL,山奈酚的浓度为35.68g/mL。2.4.3 供试品溶液的制备 取僵蚕干燥粉末20g(过65目筛)，用8倍量甲醇（内含1%盐酸）浸泡过夜后超声提取30min,滤过，残渣加入6倍量甲醇再次超声提取30min，滤过。合并两次滤液并减压浓缩至10mL，定容，摇匀，用0.45m的微孔滤过即得。2.4.4 标准曲线的制备 分别精密吸取混合标准品溶液1.0、2.0、4.0、6.0、8.0mL于10mL容量瓶中，以甲醇定容，摇匀，用0.45m的微孔滤过，精密量取20L注入液相色谱仪，测定峰面积。以峰面积积分值为纵坐标，以槲皮素、山奈酚进样量为横坐标绘制标准曲线，得一元回归方程分别为y=ax+b(r= )和y=ax+b(r= )。结果表明槲皮素在 ，山奈酚在 范围内线性关系良好。2.4.5 精密度实验 取一定浓度的标准品溶液，重复进样5次，每次20L，记录峰面积，计算RSD为 。2.4.6 稳定性实验 取供试品溶液于室温放置，分别于0、2、4、8、24h进样20L，记录峰面积，计算RSD分别为 、 。2.4.7 加样回收率实验 精密称取已知含量的样品各6份，分别加入槲皮素、山奈酚对照品，测定含量，结果平均回收率分别为 、 ，RSD分别为 、 。 2.4.8样品测定 分别精密称取各种样品，按“2.3.3”项下方法制成供试品溶液，微孔滤膜滤过后，精密吸取20L，注入高效液相色谱仪进行测定，记录,色谱峰的峰面积，计算含量，结果见表3。表3 各种僵蚕炮制品槲皮素与山奈酚含量测定结果表（g/g）炮制品种样品重量槲皮素峰面积山奈酚峰面积槲皮素含量山奈酚含量生品僵蚕清炒僵蚕麸炒僵蚕甘草砂炒僵蚕图6 槲皮素与山奈酚标准品HPLC图图7 槲皮素与山奈酚样品HPLC图3 讨论为考察不同炮制方法中炮制辅料和炮制温度对僵蚕化学成分种类和含量的影响，对僵蚕各炮制品进行了薄层色谱的鉴别研究。从图3中可以看出在方法1的条件下，各炮制品均于薄层板相应的位置上显樱红色荧光斑点 ;而图4图5中，各炮制品在方法2和方法3法的条件下均于薄层板相应的位置上显棕色斑点及分别为淡红色荧光斑点，但图4中，麸炒品和甘草砂炒品的荧光斑点较弱。由此可见，在上述3种方法中，僵蚕各炮制品的薄层鉴别未见明显差异。 僵蚕中含有的草酸铵是其抗惊厥的有效成分，同时也具有一定的抗凝作用。但生品中过多的草酸铵容易引起人体血氮升高从而导致患者昏迷和抽搐而僵蚕经过炮制后正可以适度降低草酸铵的含量。从表2中可以看出，僵蚕各炮制品中草酸铵的含量较之生品都有不同程度的下降，其中甘草砂炒僵蚕的含量下降得最为明显，约为生品僵蚕草酸铵含量的 ，麸炒僵蚕其次，而清炒僵蚕中草酸铵含量下降的最少。文献报道，生品僵蚕中槲皮素的含量为0.22mg/ g ，山奈酚的含量为0.64 mg/ g5，而本实验的结果则表明生品僵蚕中槲皮素与山奈酚的含量分别为 、 ，仅为文献报道含量的 、 并且山奈酚含量要远小于槲皮素的含量，与文献报道结果出入较大。推测是不同产地不同批次的僵蚕体内存在的未消化桑叶质与量的不同造成的。 僵蚕经过炮制后所含槲皮素与山奈酚的含量变化不大，与生品较为接近，但甘草砂炒僵蚕与麸炒僵蚕中槲皮素与山奈酚的含量降低较为明显。甘草的化学成分主要有三萜皂苷类成分及黄酮类成分两大类 ，其中三萜皂类成分主要为甘草甜素，为甘草酸的钾、钙盐，是甘草的甜味部分。甘草酸水解后得2分子葡萄醛酸和1分子18-甘草次酸，甘草次酸具有明显的中枢性镇咳作用；甘草还能促进咽喉和支气管的分泌，使痰易于咳出。此外，甘草尚有抗菌、抗心律失常、保肝等作用。黄酮类成分有甘草苷、甘草苷元异甘草苷、异甘草苷元等数十个，均具有解痉作用，以异甘草苷元的解痉作用最强10。而槲皮素和山奈酚均为黄酮醇类化合物分子结构中富含性质活泼的酚羟基，因此可以推论这些酚羟基可以与甘草