肝干细胞的研究进展.doc

肝干细胞的研究进展攀枝花学院医学院 马秉福 摘要：由于肝干细胞具有多源性、增殖能力强等特性，显示各种难治性肝病的治疗具有广阔的前景,使得肝干细胞研究成为肝脏疾病研究的热点和焦点之一。近年来，关于肝干细胞的基础研究已取得重大进展，本文就肝干细胞来源、分化调控、细胞因子影响、分离与培养等方面的研究进展作一综述。关键词：肝干细胞 来源 分化 细胞因子 分离 培养干细胞是指组织中最原始的具有多潜能性、自我更新的细胞， 但不同于组织中的一些前体细胞。虽然前体细胞也具有自我更新能力，但自我更新时间较为短暂。目前通常将干细胞分为三类 ：全能干细胞：如胚胎干细胞可以分化形成所有的成体组织细胞， 甚至发育成完整个体。多能干细胞：具有多向分化潜能，可以分化形成除自身组织细胞外的其他组织细胞，如造血干细胞、间充质干细胞 和肝干细胞等。专能干细胞：维持某一特定组织细胞的自我更新， 如肠上皮干细胞等。肝脏具有强大的再生能力，很早就有人提出肝干细胞存在假说，近年来的研究亦证实了此假说1。从定义上，肝干细胞应当具有无限增殖能力及多向分化潜能。在体内有多种细胞符合肝干细胞的特征， 如肝脏胚胎发育过程中出现的胎肝干细胞及成肝细胞、成年肝内存在 的兼性肝干细胞及其子代细胞卵圆细胞、特定情况下的成熟肝细胞 和造血干细胞等。此外，近来有人认为来自胰腺的卵圆形细胞也具有 向肝细胞分化的能力。 目前， 肝干细胞研究成为肝脏疾病研究的热点和焦点之一。 1 肝脏干细胞的种类 1.1 内源性肝干细胞 肝脏内的干细胞主要是肝实质细胞 (hepatocytes) 和胆管源性卵圆细胞(oval cel1)。近年来的大量研究推翻了早期认为肝实质细胞不能大量增殖的理论。这些研究表明2 ，成年小鼠肝实质细胞具有干细胞样的增殖能力，在特定的体内微环境下也可以进行分化。这种分化能力与免疫系统的T h l通路相关3。 当肝实质细胞受到损伤，分裂增殖能力被完全阻抑的时候，胆管中处于休眠状态的卵圆细胞能被活化，分裂成肝实质细胞和胆管细胞，完成肝脏的结构与功能的重建4。由于卵圆细胞与胆管细胞的形态特点比较相似，它们是否属同一种细胞一直具有争议。直到对胆细胞进行免疫染色并且进行追踪才证实卵圆细胞是一类具有干细胞特征的细胞。1.2 外源性干细胞 主要有骨髓干细胞、胚胎肝细胞和胰腺上皮细胞等，这些细胞都具有干细胞特性，在特定的体内微环境条件下可以分化成肝实质细胞。骨髓干细胞分为造血干细胞 (hematopoietic stem cells) 和骨髓间质干细胞 (bone marrow mesenchymal stem cel1), 它们可以在特定环境下先分化成多功能祖细胞( multipotent adult progenitor cells) , 进而分化成不同的细胞。在遗传性高酪氨酸血症的大鼠模型中发现，多功能祖细胞可以分化为肝细胞并能够完全恢复肝功能，证明骨髓干细胞具有分化成肝细胞的能力。由于卵圆细胞表面能够表达部分造血干细胞的表面标志，如 Thy-1、CD34、Sca-1等， 因此推测多功能祖细胞还可以分化成卵圆细胞，参与肝再生过程。此外还有研究表明，骨髓干细胞能够跟肝细胞进行融合5 。 胚胎肝脏中的成肝细胞 ( hepatoblast ) 增殖能力很强，并且具有双向分化和参与肝脏损伤后重建的能力。Cantz等6利用绿色荧光蛋白标记胚胎肝细胞并移植入小鼠肝脏后证实了这个结论。Fiegel等7研究发现，大鼠胚胎肝细胞也能表达干细胞标志Thy-1因子，说明胚胎肝细胞具有干细胞特性。另外，研究发现，大鼠胰腺上皮组织细胞可以转化为肝细胞，表明胰腺上皮细胞可能是一种能在适当条件下定向分化的多潜能干细胞8 。2 肝干细胞分化调控 肝干细胞向特定的细胞分化和增殖受多种因素影响， 分化调控总体上可分为细胞内调控和细胞外调控两方面。2.1细胞外调控机制 肝干细胞的活化及其分化发育与其所在的微环境有密切关系，在肝干细胞微环境中有许多调节干细胞分化的影响因素，这些因素参与干细胞及其分化的子细胞、细胞与细胞、细胞与基质、基质与基质之间短距离或长距离信号的形成和转导的复杂作用9。在这些微环境中主要包括一些细胞因子和一些非肽类化学因子。细胞因子主要包括肝细胞生长因子、转化生长因子、表皮生长因子、成纤维细胞生长因子、胰岛素样生长因子、干扰素和白细胞介素等。非肽类化学因子主要是由损伤因素作用于肝脏后导致肝细胞和胆管细胞发生损害后所释放，主要包括乙醛、乳酸、花生四烯酸、活性氧中间产物和反应性氮中间产物等。除细胞因子和一些化学因子对肝干细胞分化调控有明显作用外，尚需有细胞和细胞间的接触。如肝卵圆细胞不与肝细胞间接触，卵圆细胞就不能获得肝细胞表型，不能分化为肝细胞。但在卵圆细胞分化增殖时期，卵圆细胞和肝细胞的紧密连接和缝隙连接逐渐消失。随着卵圆细胞向肝细胞方向分化发展，它与肝细胞在功能和结构上的关系更加密切。目前认为参与肝干细胞始动阶段调节的因子主要为成纤维细胞生长因子和骨形态发生蛋白家族，在分化成熟阶段主要为抑瘤素M、糖皮质激素、肝细胞生长因子和转化生长因子等，在终末分化阶段主要是抑瘤素M、糖皮质激素、 高密度培养和细胞外基质10。 2.2 细胞内调控机制 细胞内自身调控因子的信号调控是肝干细胞分化最主要的调 控。在此调控过程中，人们所知尚有限。目前已发现有多种转录因子具有影响干细胞分化的特定功能 ，每个分化系都受特定转录因子结合物调控 ， 而每种结合物又都可在多种分化体系中表达。GATA盒、 CAAT增强结合蛋白、肝细胞核因子(HNF) l、4a、3a和6等转录因子可能在肝干细胞的分化发育中起重要作用，但对其具体调控细节所知尚少，有待进一步研究阐明9。肝干细胞在终末分化之前，有哪些因素决定其分化终止以及决定细胞分裂次数? 近来研究显示，在干细胞内可能存在一些生物钟，对细胞的分裂和分化进 行调控。另一个因素可能是细胞内的端粒和端粒酶。端粒是真核细胞染色体 末 端的氨基酸连续重复序列，端粒结构对保持染色体的稳定 十分重要，正常细胞每分裂一次，端粒缩短50200bp，若干次分裂后，端粒几乎不复存在，细胞也随之衰老、死亡。正常细胞分裂复制时，端粒的复制由D NA聚合酶完成，由于DNA复制的不完全性，使得端粒丢失，端粒长度随细胞分裂进行性缩短，因此，正常细胞的分裂次数是有限的。端粒长度可视为细胞有丝分裂的“记数器”。随着细胞端粒的进行性丢失，端粒即失去其对染色体的保护作用，细胞染色体变得不稳定，随后细胞退出细胞周期，停止增殖，进一步老化、死亡。端粒酶是一种核糖核蛋白酶，它能通过反转录过程 合成端粒片段并使其连接于染色体的端粒末端，从而维持染色体端粒长度，使细胞分裂后不缩短或缩短缓慢，使细胞衰老延缓，甚至达到“永生化”11。 3 以肝干细胞为靶点参与肝再生的细胞因子 3.1 肝细胞生长因子肝细胞生长因子(hepatic growth factor ，HGF ) 是目前已知的对成熟肝细胞刺激最为强烈的增殖刺激因子和促有丝分裂原，它可能通过刺激肝细胞活化丝裂原而促进肝细胞DNA的合成12。除了直接作用于肝实质细胞外，HGF还能通过旁分泌效应作用于具有HG受体表达的多种干细胞而促进其向肝细胞的转化。 3.2 干细胞因子 干细胞因子( stem cell factor，SCF ) 启动骨髓细胞的增殖与成熟的作用早已为人们所熟知。最近研究显示，SCF也可以参与肝再生。在小鼠肝再生模型中发现，SCF呈上调表达趋势，而用SCF基因敲除小鼠建立的肝再生模型则显示，SCF基因敲除小鼠肝再生的速度明显比正常小鼠肝再生速度慢。表明SCF能够参与肝再生，并且可能对肝细胞分裂起促进作用。 3.3 粒细胞集落刺激因子粒细胞集落刺激因子( granulocyte colony-stimula-ting factor，G -CSF ) 是骨髓造血细胞增殖因子的一种，具有刺激粒系母细胞的增殖和分化，增强成熟粒细胞功能的作用。近期研究结果表明，G - CS F可以通过动员自体骨髓干细胞能够促进部分肝移植物的再生并且 减少肝脏损伤12。 3.4 肝刺激因子 肝刺激因子( hepatic stimulator substance，HSS)是一种细胞生长启动子，它本身并不表现出促细胞的特性，但可以提高如HGF等的促进肝细胞增长用，并且降低肝细胞生长抑制因子的抑制效应13。除此之外，还有许多细胞因子如肿瘤坏死因子化生长因子、胰岛素、干扰素(IFN)等对肝再生一定作用。 4 肝干细胞定位、分离、培养和鉴定有关肝干细胞在肝脏中的定位现有两种观点，主流观点认为肝干细胞定位于Hering管，即肝内胆管的最小分支处，位于肝细胞和胆管上皮细胞之间。另一种观点认为肝干细胞位于胆管周围或胆管 区，它们体积较小而且形态上难以分类，可产生肝祖细胞和胆管上皮细胞，胆管周围的祖细胞也可能起源于肝外组织如骨髓9。干细胞分离和鉴定的理论基础是其生物学特性，包括细胞形态和结构特征及生物学表型，肝干细胞生物学研究也不例外。肝干细胞无特异标记物，因此给分离和鉴定工作带来极大困难。但目前可利用肝干细胞具有自我更新能力和多向分化潜能来分离培养和鉴定。Tani guchi等14采用CD45.2及TER119- AP C两种单抗以FACS筛选BA LB/CA Jcl小鼠胎肝细胞，去除C D 4 5 T E RI 1 9 的血源细胞后，发现通过培养 l104 C D 4 5 TER119-的胎肝细胞可形成 ( 6 040)个肝克隆形成单位( hepatic colony forming units，H- CFU- Cs )，而未作F AC S者仅形成( 1 02.3)个H- CFU- Cs。Suzuk i等根据胚胎发育中整合素亚型随发育阶段不同在肝脏细胞的不同表达，采用单克隆抗体和荧光激活细胞筛选法 从胎龄l 3.5 d小鼠胎肝的C D 4 5 TER119-细胞中筛选出 c-kit CD49f细胞，在体外培养5 d后形成多于100个细胞集落H-CFU- C， 其次为 CD49f CD29f细胞，约相当于前者的13，将其植入小鼠脾脏，可分化成肝实质细胞。将其植入动物体内不同部位后可定向分化为肝细胞、胆管细胞、胰腺及肠上皮细胞等，提示今后有可能用于治疗相关脏器及细胞疾病。Kubota等15利用一种称为STO的饲养细胞( feeder cells)，该细胞含有p EF-H1X-MC1neo质粒，可使E15 Fischer 344大鼠胎肝细胞发生永生化，形成细胞株，采用体外克隆形成分析及流式细胞仪鉴定成肝细胞，结果后者显示MH C- I 及 RTI A1 阴性、OX18低表达及细胞间黏附分子 l ( ICAM- 1 ) 和整合素-1阳性，而成年肝克隆则为 RT1 A1 OX18 I C A M- l2。虽然上述各种类型细胞均被证实具有多潜能性，但其所处的发育阶段以及体外微环境有很大不同。这些差异可能导致不同细胞在其形态、特异标记物的表达及 分化能力上表现出多样性。 5 肝干细胞移植的存在的问题和应用前景体外细胞实验的最终目的，是构建功能性的器官以替代宿主原有功能不全的器官，或将移植细胞移植到宿主体内，通过移植细胞的不断增殖逐渐发 挥功能。肝脏提供的良好生长环境有利于移植干细胞的生长，且其分泌的细胞因子更可促使肝干细胞发育为成熟的功能性肝细胞，这就是肝脏成为肝干细胞首选的移植部位的主要原因。但肝干细胞移植尚需解决的问题有 ：移植时机的问题，由卵圆细胞、骨髓干细胞或胚胎干细胞获得的肝干细胞，在其发育成熟的哪一个阶段移植可以达到最佳效果尚无明确定论，在细胞分化早期移植，细胞未具备肝 干细胞重要标志或功能；在细胞分化晚期移植，其增殖能力已大为降低，移植入肝内则难以改善肝脏功能。移植数量的问题，肝干细胞移植数量太少，在肝内难以发挥作用；移植数量太大，又面临血管阻塞等危险，而适合人体肝内移植的细胞数量尚未见报道，需要大量临床前研究来摸索最适合人类肝内移植的细胞数量。细胞移植后肝内定位跟踪的问题，目前，最常用的体内移植细胞示踪剂多为荧光物质，国外也有报道将携带Y染色体的肝干细胞移植到雌性动物肝内，通过Y染色体示踪，上述方法存在的问题是了解移植细胞体内定居、增殖情况时，均需取得肝脏活组织做病理切片检查，但这就不能动态观察移植细胞在宿主体内的连续性 变化，同时不适合未来临床的应用，活体示踪剂可 以动态连续的观察移植细胞在肝内的定居、增殖情况，成为近年来细胞移植研究领域的热点问题，但活体示踪剂标记效率不高的问题尚未解决，所以，一种良好示踪剂的寻找成为细胞移植必须攻克的难题。干细胞研究者认为，随着研究的深入和干细胞移植的不断进步，肝干细胞必将使许多传统医学方法难治疗的“绝症”发生革命性的变化，肝干细胞移植治疗肝硬化门静脉高压症及肝衰竭就是其中之一。虽然应用肝干细胞治疗肝硬化门静脉高压症等难治性肝病的研究尚处于初始阶段，但干细胞自身的增殖、分化特性和修复能力必将受到越来越多的关注，其未来的应用前景十分广阔。一种体外人工肝辅助装置已经由美国VT生物技术公司研制成功并将进入我国临床研究。此外，肝干细胞还可以作为基因治疗的载体或靶细胞治疗肝硬化、肝癌、遗传性代谢性肝病等难治性肝病。参考文献1 Thorgeirsson S S，Grisham JWOverview o f recent experimental studies on liver stemcellsSemin Liver，Dis，2003，23：303-312 2 OVERTURF K，ALDHALIMY M，OU C NSerial transplantation rev eals t he stem-cell-like regenerative potential of adult mouse hepatocytes J A m J Pathol，1997，151(5):1273-1280 3 BELINDA K， BARARA A,VANCE B M, et al. 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