赵宁民---201312利拉鲁肽对βTC-3细胞的保护作用研究.ppt

利拉鲁肽对 TC 3细胞的保护作用 河南省人民医院药学部赵宁民2013年12月 利拉鲁肽简介 利拉鲁肽对 TC 3细胞的保护作用 小结 主要内容 利拉鲁肽是一种人胰高糖素样肽 1 GLP 1 类似物 用于治疗糖尿病 商品名 诺和力 Victoza 2009年7月 在欧盟上市 2010年1月 在日本上市 2010年1月25日 在美国上市 2011年10月9日 正式在中国上市 用于治疗成人2型糖尿病 目前认为 细胞功能进行性减退和胰岛素抵抗是2型糖尿病的主要病理生理基础 其中 细胞功能进行性减退是糖尿病持续进展 患者血糖难以长期稳定控制的重要原因之一 胰岛 细胞衰竭是糖尿病致病机制的核心 也是治疗2型糖尿病的关键靶点 能够保护 细胞就能够延缓糖尿病的进程 肠促胰素是机体摄取食物后分泌的一类激素 它们可以调节胰岛素的分泌 主要的肠促胰素有两种 胰高血糖素样肽 1 GLP 1 和葡萄糖依赖性促胰岛素多肽 GIP 胰高血糖素样肽 1 GLP 1 是一种肠肽类激素 是在研究小肠分泌物过程中发现并分离的 由30个氨基酸残基组成 由肠道L细胞分泌 受进食及神经内分泌等多种因素调节 多项研究表明 GLP 1可以有效降低2型糖尿病患者的血糖水平 改善 细胞功能 减少低血糖风险 体内二肽基肽酶IV DPP IV 可将天然GLP 1迅速降解 使其半衰期仅为1 2min 很难直接用于2型糖尿病的临床治疗 诺和诺德公司在GLP l原有的结构基础上进行改造 产生了疗效类似但半衰期显著增长的GLP l类似物 利拉鲁肽 目前认为GLP 1的肠促胰岛素效应较为明显 GLP 1可以刺激胰岛素基因表达和合成 恢复葡萄糖耐受细胞对葡萄糖的反应性 增加葡萄糖刺激的胰岛素分泌 健康人体内GLP 1的作用非常明显 但是T2DM患者的GLP 1功能明显下降 因此GLP 1相关药物成为了治疗T2DM的一类新型药物 利拉鲁肽简介 利拉鲁肽对 TC 3细胞的保护作用 小结 主要内容 2型糖尿病 T2DM 是一种由遗传因素及环境因素相互作用且共同参与发病的多因子疾病 具有明显的家族患病倾向 研究发现 同卵双胞胎患病一致性是45一90 异卵双胞胎患病一致性为3一37 而从葡萄糖耐受的角度去考察同卵双胞胎的一致性的时候 这个比例通常高于70 遗传因素是2型糖尿病发病的重要因素GhoshS SehorkNJ GenetieanalysisofNIDDM Thestudyofquaniitativetraits Diabetes 1996Jan 45 l 1一14 2型糖尿病遗传因素钙蛋白酶10 CAPN一10 ATP敏感性钾通道 KATP 胰岛素 INS 胰岛素受体 IR 胰岛素受体底物 1 IRS 1 葡萄糖转运蛋白 GLUT2 胰淀素 IAPP 等 Noma于1983年首先在心肌细胞发现ATP敏感钾通道 KAPT 随后研究证实 胰腺B细胞 骨骼肌细胞 血管平滑肌细胞 血管内皮细胞等也富含KAPT 磺脲类受体1 SUR1 和内向整流性钾离子通道 Kir6 2 组成胰腺 细胞KAPT KAPT通道的开放维持着 细胞的静息电位 进食后高血糖使细胞内糖代谢增加 胞内ATP ADP比例升高 细胞膜上的KAPT通道关闭 细胞膜去极化 当膜电位达到一定阀值时 膜上的电压依赖性钙通道迅速开放 钙离子内流 触发胰岛素分泌 2型糖尿病的发病机制与胰岛素抵抗和胰岛素分泌的相对性缺乏有关 而胰岛 细胞膜KATP控制着糖诱导的胰岛素分泌任何引起KATP通道活性降低的因素都可导致胰岛素分泌减少 最终引发2型糖尿病 胰腺 细胞ATP敏感性钾通道 KATP 是由SUR1和Kir6 2按1 1比例组成的八聚体4复合物 Kir6 2 内向整流性钾离子通道 决定钾离子选择性内向整流作用的强弱 Seino等发现Kir6 2基因敲除小鼠糖诱导的细胞膜去极化 钙离子内流及胰岛素分泌消失 表明Kir6 2在调节胰岛素分泌中的作用无可替代 利拉鲁肽是否对Kir6 2是否有影响 采用含10 胎牛血清的1640培养基 置于37 含5 CO2的CO2恒温孵育箱中培养24h 选取对数生长期细胞进行实验 TC胰岛素瘤细胞系来源于大鼠胰岛素启动因子控制下表达SV40T抗原转基因小鼠的胰岛素瘤细胞 小鼠胰岛 细胞瘤 TC 3细胞株的培养 取经处理的 TC 3细胞适量 加入0 25 胰蛋白酶消化 收集并用PBS洗涤 然后加入1mlRNAisoPlus TotalRNA提取试剂 于室温条件下静置10min 每1mlRNAisoPlus加入0 2ml氯仿 置振荡器上振荡15秒 室温放置5分钟 于4 12000g离心15分钟 取上层水相转移至1 5ml离心管 加入0 5ml异丙醇 充分混匀后 在室温下静置10分钟 再次于4 12000g离心10分钟 小心弃去上清 缓慢地沿离心管壁加入75 的乙醇lml 然后于12000g4 离心5分钟 小心弃去乙醇 于室温干燥沉淀5分钟后 加入适量的RNase free 无RNA酶 水溶解沉淀 细胞总RNA的提取 反转录 应用PrimeScriptRTreagentKit PerfectRealTime 试剂盒进行反转录 试剂使用量分别为 5 PrimeScriptBuffer4 l PrimeScriptRTEnzymeMixI1 l Random6mers 100 M 1 l OligodTPrimer 50 M 1 l TotalRNA6 l RNaseFreedH2O7 l Total20 l 反转录反应条件为 37 15min 85 5sec 4 以GenBank中登录的小鼠Kir6 2基因编码区序列为模板设计引物应用SYBRPremixExTaqII PerfectRealTime 试剂盒进行实时定量PCR PCR反应条件如下 Step195 30sec Step295 30sec 40 60 30sec 40 72 30sec 40 Step372 5min Real timeRT PCR 利拉鲁肽对内向整流性钾离子通道 Kir6 2 的影响 TC 3细胞分别用0 g ml 0 1 g ml 1 g ml的利拉鲁肽处理24h后 应用RealtimePCR检测Kir6 2mRNA 经利拉鲁肽处理后细胞Kir6 2mRNA随着利拉鲁肽的浓度的增加而增加 以0 g ml组为对照组 设对照组为100 以对照组百分比表达图 n 3 mean SEM 利拉鲁肽对内向整流性钾离子通道Kir6 2有影响随着利拉鲁肽浓度的升高 Kir6 2mRNA表达增加利拉鲁肽通过影响内向整流性钾离子通道Kir6 2 影响KAPT通道的开放 影响胰岛素分泌 结论 进一步的验证 棕榈酸棕榈酸 Palmiticacid 又称软脂酸 是一种饱和高级脂肪酸 以甘油脂的形式普遍存在于动植物油脂中 在自然界中分布很广 糖尿病患者的一个主要特征为血脂障碍 患者血液中游离脂肪酸增加 脂蛋白成分改变 研究发现游离脂肪酸的增加可以促进鼠胰岛细胞凋亡 棕榈酸对原代培养的人胰岛具有很强的毒性作用 可以诱导 细胞凋亡 减少细胞增殖 损害 细胞功能 棕榈酸可以通过神经酰胺线粒体凋亡通路对 细胞造成损害 而单不饱和脂肪酸油酸可以增加线粒体Bcl 2 在细胞凋亡过程中 Bcl 2家族成员起着至关重要的作用 的表达对 细胞起到保护作用 配制棕榈酸精密称取棕榈酸 PA 适量 溶于无水乙醇中 使其终浓度为200mmol L 然后将其溶于10 的Fattyacid freeBSA 无脂肪酸牛血清白蛋白 中 将pH值调至7 过滤后 20 保存 利拉鲁肽及棕榈酸处理接种细胞后 置培养箱中培养 24h后加入0 4mmol L的棕榈酸适量 置培养箱中培养24h后检测Kir6 2mRNA 接种细胞后 置培养箱中培养 24h后加入1 g ml的利拉鲁肽适量预处理1h 然后加入0 4mmol L的棕榈酸适量 置培养箱中培养24h后检测Kir6 2mRNA 单独使用棕榈酸可以使 细胞KATP通道亚基Kir6 2mRNA表达下降同时给予棕榈酸和利拉鲁肽组 TC