1 基因工程概述.ppt

基因工程 主讲人 孙全E mail sunquan 重庆邮电大学生物信息学院CollegeofBioinformation ChongqingUniversityofPostsandTelemunications GeneticEngineering 感谢舒坤贤老师提供的原始课件 参考书籍 References 4 Sambrook J 等 分子克隆实验指南 第三版 2001 3 吴乃虎 基因工程原理 第二版 上 下册 科学出版社 1998 2001 2 张惠展 基因工程 华东理工大学出版社 2005 1 马建岚 基因工程学原理 西安交大出版社 2001 绪论 KathrynSullivan Thefirstwomanwalkinginspace Ifirstsawtheearth thewholeearth fromtheshuttleChallengerin1984 Theviewtakesyourbreathawayandfillsyouwithchildlikewonder 杨利伟拍摄的美丽的地球家园 Lifedistinguishesourglobefromanyotherplanets 生命使我们的家园区别于所有别的星球 Lifeisbeautiful Diverseisbeautiful Howisitprogrammedsotimelyandsocorrectly Inheritableisbeautiful Whetheryoubelieveitornot Theonlythingaman gives hisbabyissomethingcalledDNA Nothingwouldbemorefascinatingthantoexplorethemysteriesoflifeandourselves 父亲 传 给了女儿什么 DNA Simpleisbeautiful TheMicrobes Evolutionaryisbeautiful Biotechis biologicallyapplicable Nothingismorebeautifulthanlife 一 基因工程的含义 1 生物技术是一门最古老的技术 2基因工程 GeneticEngineering 的概念A狭义 基因工程是指将一种生物体 供体 的基因与载体在体外进行拼接重组 然后转入另一种生物体 受体 内 使之按照人们的意愿稳定遗传并表达出新产物或新性状的DNA体外操作程序 也称为重组DNA技术 DNARecombination 或分子克隆技术 MolecularCloning 因此 供体 受体 载体是重组DNA技术的三大基本元件 B广义 基因工程是指重组DNA技术的产业化设计与应用 包括上游技术和下游技术两大组成部分 上游技术指的是基因重组 克隆和表达的设计与构建 即重组DNA技 而下游技术则涉及到基因工程菌或细胞的大规模培养以及基因产物的分离纯化过程 克隆的寓言 造人是人类的一种集体潜意识 ThenGodsaid Letusmakehumankindinourimages accordingtoourlikeness 上帝为什么要照着自己的样子造人 最早的无性繁殖传奇 上帝从亚当身上复制出夏娃 Thenthemansaid Thisatlastisboneofmybonesandfleshofmyflesh thisoneshallbecalledwoman forourofManthisonewastaken 肋骨造人象征什么 组织工程学 遗传信息相传递 体细胞核移植 16世纪 维萨里 人体的构造 男人的肋骨与女人一样 不知道他是否想过 一个比肋骨小得多的体细胞便能 复活 一个生命 TheFistSinandItsPubnishment 亚当夏娃被逐出伊甸园 人类开始了最初的有性繁殖 进步意义 有性生殖产生的基因重组 导致了变异 物种越变越复杂 产生了进化上的飞越 矛盾 假如我们的始祖只有男女二人 那么 谁是异族 如果这二人是同族的话 那么他们的性关系就是近亲相好 我们作为他们的子孙 就是由罪孽的结合 违反伦常的有性生殖 而繁衍出来的 这个谜之所以引人注目就在于它常常伴随着意味深长的论理问题 几个古代圣贤的传说 圣母玛利圣灵感孕 耶稣的诞生 伏羲的母亲前氏踏雷泽的 大迹 而生伏羲 大禹的母亲 见星贯昂 梦接意感 而后又 吞神珠 才生下大禹的 太平御览 黄帝的母亲 见大雷绕北斗 枢星光照郊野 然后感而孕 生下黄帝 初学记 圣人皆无父 感天而生 春秋公羊传 现在 多莉 的 造物主 吃禁果了 对造出新罪孽的恐惧 就是基因时代教俗两界新的心里压力 多莉 的研究者伊斯维姆 穆特 克隆羊 多莉 吴明杰小组 5只克隆猪 西游记 中的孙悟空与美国克隆猴子 美国克隆了猴子 齐天大圣 有何感想 争论的焦点是克隆人问题 克隆 其实是我们的日常生活中经常遇到 只是没叫它 克隆 而已 无心插柳柳成荫 马铃薯 你见过克隆人吗 人类有足够的力量阻止 克隆人 的诞生吗 InGeneTimes Tobe ornottobe Thisisaproblem 二 基因工程诞生的理论基础 1 基因的研究 孟德尔的 遗传因子 TheCenturyoftheGenebeganwiththere discoveryofthebasiclawsoflife Thelawsofinheritanceoflife 丹麦生物学家Johannsen 创造 基因 gene 一词 意为 给予生命 Morgan把基因定位在染色体上 Miescher发现了核酸 nucleicacids 2 遗传物质是DNA 少数病毒除外 ArealbeginningoflifesciencesbeganwiththeestablishmentoftheDoubleHelixModelofDNA 3 DNA双螺旋结构 MauriceWilkins RosalindFranklin 1957年Crick又提出了遗传信息传递的 中心法则 DNA RNA protein 1964年MarshallNirenberg和GobindKhorana等终于破译了64个遗传密码 4 中心法则和遗传密码 移动基因 断裂基因 假基因 重复序列及重复基因 重叠基因 5 基因的现代概念 6 HumanGenomeProject Genetics tostudyasingleorafewgenesGenomics tostudyallgenesinagenomeorgenomes 生命的奥秘蕴藏于 四字天书 之中Secretsinthe 4LetterBook ofLife GCTTCTTCCTCATTTTCTCTTGCCGCCACCATGCCGCCACCATCATTTTCTCTTGCCGCCACCATGCTTCTTCCTCATTTTCTCTCCACCATGCCGCCACCACGCCACCATGCTTCTTCCTCATCTCGCTTTCTTGCCGCCACCATGCCGCCACCGCTTCTTCCtTCTCT Lifesciencesaresequence based 元素周期表奠定了二十世纪物理 化学研究和发展的基础 元素周期表 基因组序列图 将奠定二十一世纪生命科学研究和生物产业发展的基础 人类基因组计划 的科学意义 人体解剖图奠定了 现代医学发展的基础 人类基因组计划 的社会意义 人类基因组计划 在科技合作与共享 人类和谐与进步 世界和平与持续发展等多方面的意义远远超过了 曼哈顿原子弹计划 和 阿波罗登月计划 三 基因工程诞生的技术突破 1 限制性内切酶 restrictionenzymes 1970年H O Smith等分离出第一种限制性核酸内切酶 WernerArber理论预见限制酶 DanielNathans用限制酶切得SV40DNA片断 HamiltonO Smith得到第一个限制酶 1978年Nobel生理或医学奖 2 DNA连接酶 ligase 1967年5个实验室几乎同时发现了DNA连接酶 3 载体 vector 1972年前后使用小分子量的细菌质粒和 噬菌体作载体 在细菌细胞里的大量扩增 4 感受态体系 1970年M Mandel和A Higa发现经过氯化钙处理的大肠杆菌容易吸收噬菌体DNA 1972年S Cohen发现这种处理过的细菌同样能吸收质粒DNA 5 琼脂糖凝胶电泳 1960s发明了琼脂糖凝胶电泳 可将不同长度的DNA分离开 6 DNA测序技术 1975年F Sanger A Maxam和W Gilbert发明了DNA快速测序技术 1980年Nobel化学奖 四 基因工程的发展历史 1980年Nobel化学奖 1972年斯坦福大学的PaulBerg小组完成了首次体外重组实验 1 Berg的开创性实验 将SV40的DNA片断与 噬菌体的DNA片断连接起来 用DNA末端转移酶 而非限制性内切酶 2 Boyer Cohen实验 1973年斯坦福大学的S Cohen小组将含有卡那霉素抗性基因的大肠杆菌R6 5质粒与含有四环素抗性基因的另一种大肠杆菌质粒pSC101连接成重组质粒 具有双重抗药性 后来又把非洲爪蟾核糖体基因片断同pSC101质粒重组 转化大肠杆菌 并在菌体内成功转录出相应的mRNA 这是第一次成功的基因克隆实验 Boyer Cohen实验 StanleyCohen1986Nobel生理或医学奖 HerbBoyer 3 基因工程的成熟和腾飞 2000年 法国科学家利用基因技术 制造 出了一只可以发出绿色荧光的兔子 Alba 应用了受精卵显微注射技术 从水母身上采集了荧光蛋白 基因改良后 使它的发光率比原先提高了两倍 再将该基因植入到了兔子的受精卵中 由此培养出了会发光的兔子Alba 在普遍光线下 它看上去与其它同类没有区别 但是在较暗的光线下 它的身体就会放射出奇异的绿光来 2 重组体的制备 五 基因工程的主要操作内容 1 目的基因的获取 从复杂的生物基因组中 经过酶切消化或PCR扩增等步骤 分离出带有目的基因的DNA片断 将目的基因的DNA片断插入到能自我复制并带有选择性标记 抗菌素抗性 的载体分子上 将重组体 载体 转入适当的受体细胞中 4 克隆鉴定 3 重组体的转化 挑选转化成功的细胞克隆 含有目的基因 5 目的基因表达 使导入寄主细胞的目的基因表达出我们所需要的基因产物 制造带有抗生素抗性基因或有产生病毒能力的基因的新型微生物有可能在人类或其它生物体内传播 1 对环境的影响 2 新型病毒的出现 重新组合一种在自然见尚未发现的的生物性状有可能给现有的生态环境带来不良影响 一 基因工程的安全隐患 六 基因工程的安全性 将肿瘤病毒或其它动物病毒的DNA引入细菌有可能扩大癌症的发生范围 4 人造生物扩散 新组成的重组DNA生物体的意外扩散可能会出现不同程度的潜在危险 3 癌症扩散 1 公众的担忧 二 重组DNA研究的安全准则 1973年美国的公众第一次公开表示担心应用重组DNA技术可能会培养出具有潜在危险性的新型微生物 从而给人类带来难以预料的后果 1974年美国国立卫生研究院 NIH 考虑到重组DNA的潜在危险 提请PaulBerg博士组成一个重组DNA咨询委员会 这个由11名分子生物学和重组DNA权威学者组成的委员会在同年7月发表公开信 science 158 303 要求在没有弄清楚重组DNA所涉及的危险性范围和程度 以及在采取必要的防护措施之前 暂停两类试验 带抗生素抗性和肿瘤病毒及动物病毒 2 专家的态度 3 制定安全规则 1976年6月23日 NIH正式公布了 重组DNA研究的安全准则 规定了安全防护 物理防护和生物防护 标准以及禁止若干类型的实验 1979年 1981年 1989年NIH又做了多次修改 放宽了许多限制 分4级 P1 P4级 1 实验室的物理安全 4 基因工程的安全措施 一般装备良好的普通微生物实验室 P1级实验室 P2级实验室 在P1级实验室的基础上还装备有负压的安全操作柜 全负压的实验室 同时装备安全操作柜 P4级实验室 专用的实验大楼 周围与其它建筑物应有隔离带 具有最高安全防护措施 P3级实验室 在自然环境中无法存活 2 实验室的生物安全 分3级 大肠杆菌 EK1 EK3级 EK1级的大肠杆菌 在自然环境中一般都要死亡 EK2 EK3级大肠杆菌 第一个 安全 菌株是K12 1976年 很不实用 已淘汰 3 载体的安全 应该是失去了自我迁移的能力 不会自动从 安全 的菌株转移到 不安全 的菌株中 容易构建 如pMB9 pBR322等 一 基因工程在农业生产中的应用 1 提高植物的光合作用效率 七 基因工程的应用 改变与光合作用有关的酶的结构和组成 如二磷酸核酮糖羧化酶 1 提高CO2的固定率 改变光能交换系统的分子的基因结构 2 提高光能吸收率和转化率 使非固氮植物转变为固氮植物或能与根瘤菌共生固氮 2 提高豆科植物的固氮效率 是农业生物技术的主要内容 是将克隆到的特殊基因导入受体植物 使之增加一些优质性状 高产 稳定 优质 抗虫 抗病等 3 转基因植物 大棚种植的转基因 抗青枯病 马铃薯 世界各国转基因作物大田释放情况 1987 1 1998 4 将外源基因导入动物细胞 并在基因组内稳定整合 遗传给后代 使动物成为生物反应器生产有用的活性蛋白等 4 转基因动物 在乳汁中分泌人组织纤溶酶源激活物 TPA 和尿激酶的转基因小鼠 分泌a1抗胰蛋白酶的转基因山羊等 第一例转基因动物 转基因超级小鼠 二 基因工程在工业中的应用 克隆各种参与纤维素降解的酶的基因 导入酿酒酵母 就可能利用廉价的纤维素来生产葡萄糖 发酵成酒 用外源基因改造酿酒酵母 产生优质的啤酒 或用酿酒酵母生产蛋白质等 1 纤维素的开发利用 2 酿酒工业 三 基因工程在医药上的应用 1976年 27岁的风险投资人RobertSwanson与UniversityofCalifornia的教授HerbBoyer共饮了几杯啤酒 讨论了基因工程技术的商业前景 讨论结束时 他们决定建立一个公司 并取名为Genentech GeneticEngineeringTechnology 第一个基因工程公司在学术界和商业界的满腹怀疑中诞生了 Genentech的骄人业绩 制造新型疫苗 如HIV 乙肝 丙肝 霍乱 痢疾 SARS 2 用微生物生产药物 3 技术设计高效高特异性的生物制剂 4 研制疫苗 1 用转基因植物或动物生产药物 大肠杆菌或酵母菌生产激素 如胰岛素 干扰素等 应用定点突变技术设计蛋白质或酶的结构 制造出高效高特异性的生物制剂 美国已批准上市的基因工程药物 1997 7 中国已经批准上市的基因工程药物 1998 5 我国生产的基因工程疫苗和药物 6 法医鉴定 7 基因治疗 5 基因诊断 将正常的外源基因导入靶细胞中以弥补靶细胞所缺失或突变的基因 或抑制异常表达的基因 基因病 肿瘤 心血管病 糖尿病等 仍在探索阶段 第一例基因治疗的疾病是1990年9月FDA批准的用ada 腺苷脱氨酶 基因治疗SCID 严重型联合型免疫缺陷症 第一例接受治疗的是一位4岁的女孩 用带有重组质粒的 超级菌 分解油 烷烃类 有机农药污染 四 基因工程在环境保护中的应用 1 检测水污染 2 生物降解 用重组