TTC肉汤二倍稀释法测MIC.ppt

几种抗菌药物的最小抑菌浓度的测定 MIC试验 微量肉汤二倍稀释法 一 目的 1 掌握微量肉汤二倍稀释法测定抗菌药物MIC的基本步骤 能准确测出各种抗菌药物的MIC值 了解单药的抗菌活性2 为后面的棋盘法设计棋盘做准备 求取棋盘的中心浓度 二 意义 1 通过对MIC值的测定了解药物的体外抗菌活性2 为临床选药提供依据3 耐药检测 三 菌种 1 大肠杆菌 标准菌株25922 2 沙门氏菌 标准菌株 3 金色葡萄球菌 标准菌株 以上三种菌株均由中国兽药监察所提供 四 药品 硫酸庆大霉素 批号 含量 厂家 阿莫西林 批号 含量 厂家 硫酸四环素 批号 含量 厂家 恩诺沙星 批号 含量 厂家 阿米卡星 批号 含量 厂家 氟苯尼考 批号 含量 厂家 五 培养基 MH肉汤培养基 用去离子水配制5g L显色剂TTC 氯化三苯四氮唑 六 器材 96孔细胞培养板 培养皿 移液枪 1ml和200 l枪头 EP管 锥形瓶 试管架 酒精灯 酒精棉球等分析天平 超净工作台 37度恒温培养箱 烘箱 七 方法步骤 1 药液的配制及除菌配制根据药物的效价或是含量及所需要的体积 计算出药物所需的量 并准确称取所需的各种抗菌药物 用适宜的溶剂及稀释及稀释剂将药物稀释至所需的浓度 除菌抗菌素药物通过过滤的方式过滤 化学合成类药物通过过滤或是高压灭菌的方式进行除菌 2 不同的抗菌药物原液配制所需的溶剂溶剂为PH4 5PBS缓冲液的 四环素类溶剂为PH6 0PBS缓冲液的 青霉素G 半合成青霉素类 头孢菌素类 多粘菌素B硫酸盐溶剂为PH7 8PBS缓冲液的 氨基糖苷类 林可或氯林可霉素 3 MIC的测定 微量二倍稀释法 第一步 在96孔板每个孔加入含TTC的空白肉汤100 l 图表 第二步 在A B C三排的第一孔加配好的药液A 浓度为512IU ml或 g ml 100 l 然后对药物进行二倍稀释 即 第一孔中加入药液后用移液枪充分吹打 至少三次以上 使药物与肉汤充分混匀 然后吸取100 l加入第二孔再充分吹打使之与肉汤充分混匀 照此重复直至最后一孔 吸取100 l弃去 此时每孔药物浓度从左到右依次为 256 128 64 32 16 8 4 2 1 0 5 0 25 0 125 单位 IU ml或 g ml 图表 2020 3 13 12 可编辑 第三步 再在每一孔中加入稀释好的菌液100 l 这样就形成测定一个药物MIC值的三次重复 A B C三排样品 此时每孔药物浓度即最终药物浓度从左到右依次为 128 64 32 16 8 4 2 1 0 5 0 25 0 125 0 06 单位 IU ml或 g ml 图表 第四步 在同一块板上的G排上做一排阴性对照 仅加空白肉汤不加菌液 和在H排上做一排阳性对照 加菌液不加药液 第五步 将96孔板放入37度恒温培养箱16 20小时后 观察结果 图表 第一步第二步第三步第四步 八 观察及判断结果 1 若有菌生长TTC会显示红色 若没有细菌生长TTC则不变色 2 MIC值的判定 96孔板上横排中未变红色的最后一孔所对应的浓度便为该药的MIC值 3 观察所做的阴性对照和阳性对照结果4 记录结果并将每种药物的MIC值报告老师 九 注意事项 1 无菌操作 除移液枪和96孔板外其他所有用具都需经过高压灭菌处理 超净台使用前后都需打开紫外灯进行消毒 不能拿酒精面球球擦挡板 操作前洗手 用酒精棉球擦手 每次枪头过瓶口 瓶口都要经火焰烧过 移液枪和枪头不能在究竟灯上烤 操作过程中加液尽可能不将96孔板盖完全打开 2 其他注意事项 1 培养板上用标签纸做好标记 写明组别 做什么菌 什么药 以及各组对照 2 每药做三个重复 每个板做一个阴性对照和一个阳性对照 3 废液缸 超净台内用过的不需要的东西都必须放到废液缸内 不能在台面乱扔 4 实验完后要收拾好台面 所有公用设施恢复原位 十 记录结果的格式 例如 菌对 药的MIC值 g ml或是UI ml 十一 讨论 1 微量肉汤二倍稀释法应注意那些环节才能准确测定MIC 2 MIC试验对临床选药的意义以及它的局限性 3 TTC的作用机理 十二 分组 整个班分为6个组 每组11人 1 2组做8种药对大肠杆菌的最小抑菌浓度3 4组做8种药对沙门氏菌的最小抑菌浓度5 6组做8种药对金色葡萄球菌的最小抑菌浓度1 2 3组在今天上午完成实验 4 5 6组在下午过来完成实验 每个大组要做4块96孔板 由4个同学来完成 每组的物品清单 96孔细胞培养板 6块 平皿3块 移液管