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CHIP PROTOCOL（基于millipore EZ-CHIP catalog#17-371）：实验原理：在活细胞状态下固定蛋白质DNA复合物，并将其随机切断为一定长度范围内的染色质小片段，然后通过免疫学方法沉淀此复合体，特异性地富集目的蛋白结合的DNA片段，通过对目的片断的纯化与检测，从而获得蛋白质与DNA相互作用的信息。 实验步骤：第一天：【实验材料准备】： 1000ul、100ul、200ul、20ul移液器，大、中、小号tip，1.5ml EP管，200ul PCR管。【实验仪器准备】： 台式低温离心机，超声仪，电泳设备一套，旋转混匀仪，层析柜。【实验试剂准备】：SDS lysis buffer复温，使其充分溶解，避免沉淀；protease inhibitor cocktail室温下充分解冻；PBS预冷（若使用试剂盒提供10xPBS，使用前还需用去离子水稀释成1xPBS工作液）。（一）、细胞的甲醛交联与超声破碎*。1、收集细胞（1-2x107），加入37%甲醛，使得甲醛的终浓度为1%（0.7%）。2、室温孵育10min（精确计时）。3、及时终止交联：加10x甘氨酸终浓度为1x。混匀后，在室温下放置5min。4、沉淀细胞（700g 4 2-5min），用冰冷的PBS清洗细胞2次。5、弃上清（细胞沉淀可以暂时冻存于-80备用）。6. 准备裂解液（1ml SDS lysis buffer+5ul protease inhibitor cocktail）；按照细胞量（1x107 hela细胞对应1ml SDS lysis buffer）加入SDS Lysis Buffer，重悬细胞。分装成300-400ul1管（裂解产物可以-80冻存备用）。7、超声破碎（根据具体情况调整）：普通超声仪： 3档 冲击15s 冰上放置45s 共5次Bioruptor超声神器： 中档 冲击15s 停顿45s 14次（更均一更集中）8、琼脂糖凝胶电泳鉴定：取1x105个细胞，加入CHIP dilution buffer至终体积50ul，进行解交联后电泳Option1a. 加入RNase A（10mg/ml）1ul，37孵育30分钟。b. 加入蛋白酶K 1ul，62孵育2小时。c. 取上清跑胶（2%琼脂糖凝胶 电压130V 时间20min），smear条带集中在200-1000bp即可，500左右为佳。 Option2a. 加入蛋白酶K 1ul，62孵育2小时。 b. 每50ul样本加入0.25ml结合试剂A（5倍体积），充分混匀。 c. 将上述混合液转移至吸附柱中，吸附柱放在收集管内。 d. 1000015000g离心30秒，去下清。 e向吸附柱内加入洗涤液B 500ul，1000015000g离心30s，去下清。 f. 空离30s，1000015000g。 g. 将吸附柱转移至新的EP管，向吸附柱中心滴加50ul洗脱液C，1000015000g离心30s，洗脱液即为纯化回收的DNA。 h. 取上清跑胶（2%琼脂糖凝胶 电压130V 时间20min），smear条带集中在200-1000bp即可，500左右为佳。9、离心去除不溶物质（1000015000g 4 10min），收集上清，分装至100ul 1管，-80可保存2个月。【实验补充及注意事项】：1、不是所有CHIP都需甲醛固定。做甲醛固定的为X-ChIP，而不需要固定的为N-ChIP。native ChIP主要用于组蛋白修饰、核小体定位的研究,由于组蛋白与DNA之间的作用力较强，因此N-CHIP不需要采用甲醛固定，而是让DNA结合蛋白与DNA之间保持一种自然状态，采用微球菌核酸酶对染色质进行消化，比如： Histone H3 and Histone H4 都不需要交联反应, 因为它们本身来说和DNA结合的非常紧密. 组蛋白H2A和H2B并不是紧密联接,但是在native ChIP中依然可以不需要交联反应.X-CHIP适用于结合力较弱的DNA-蛋白质相互作用的研究。2、当用甲醛处理时，相互靠近的蛋白与蛋白，蛋白与核酸（DNA或RNA）之间会产生共价键。例如细胞内，当TF与Promoter相互结合（生物意义上的结合）时，它们必然靠的比较近，或者契合在一起，这个时候用甲醛处理，能使它们之间产生共价键。甲醛的交联反应是完全可逆的，交联的进程可被加入的甘氨酸终止。3、交联时间需要预实验来确定。交联时间如果过长，细胞染色质难以用超声波破碎，影响ChIP结果，而且实验材料也容易在离心过程中丢失，另外基因组上结合了太多的蛋白，也会增加背景；交联时间如果过短，则交联不完全，产生假阴性。4、超声波是使用机械力断裂染色质，容易引起升温或产生泡沫，这都会引起蛋白质变性，进而影响ChIP的效率。所以在超声波断裂染色质时，要在冰上进行，且要设计时断时续的超声程序，保证低温。使用普通超声仪时超声探头要尽量深入管中，但不接触管底或侧壁，以免产生泡沫。总超声时间也不要太长，以免蛋白降解。5、有研究建议解交联后琼脂糖凝胶电泳鉴定，具体步骤如下：取5ul超声破碎后产物，加入5MNaCl（终浓度为0.2M NaCl），65处理2h解交联，电泳检测超声效果。一般，理想的超声破碎得到的片段大小是200bp1000bp（以3个核小体左右大小为宜，大约500bp左右）。普通超声仪效果：Bioruptor超声效果：（二）、预清洁及抗体孵育。10、准备足够Dilution buffer（900ul dilution buffer+4.5ul protease inhibitor cocktail）。11、每100ul的超声破碎产物中（冰上解冻），加入900ulChIPDilutionBuffer。再各加入60ulProteinGAgarose/SalmonSpermDNA（预清洁），4旋转混匀1h*。12、1h后，在4静置2min沉淀，4 3000-5000g离心1min。13、取上清，每个样本留取10ul做为input，4保存备用*。14、收集剩余约1ml上清至新EP管，加入IP抗体（具体加入抗体量具体调整）*。 阳性对照：加入1ug anti-RNA polymerase抗体 阴性对照：加入1 ug目的抗体来源种属的IgG 实验组：加入目的抗体（1-10ug，可根据抗体说明书决定用量，一般3ug左右）15、4旋转混匀过夜（12-16h）。【实验补充及注意事项】1、吸取琼脂糖珠子的中号tip需减头，避免机械力破坏珠子，且珠子需充分混匀。2、鲑鱼精子DNA包被琼脂糖珠子，因为鲑鱼精子用于降低降低染色质DNA与琼脂糖珠子的非特异性结合。Proterin A/G可以与抗体Fc段结合。蛋白质A结合到IgG的Fc部分。蛋白质G选择性结合到IgG的Fc部分，但也能结合到Fab区域，因此可用于纯化IgG1的Fab片段。 3、input是用来检查PCR系统是否work。4、抗原抗体之间的结合是通过抗体特异性的识别抗原表位并结合的，有的抗体识别的抗原表位比较小，不容易暴露，在ChIP实验中容易被DNA包裹，从而使抗体无法结合，因此用来做ChIP的抗体一般是需要经过chip实验验证的，必须是IP级别的抗体。5、单抗与多抗的选择：单抗特异性强，背景低。但是单抗有一个致命的弱点，就是识别位点单一，而在ChIP甲醛交联的过程中，很有可能该位点被其它蛋白或核酸结合而被封闭，导致单抗不能识别靶蛋白。多抗虽然没有这个问题，但是多抗特异性较差，背景可能会偏高。一般而言，如果没有十足把握（单抗的识别位点远离靶蛋白与核酸结合的区域），选择多抗比较稳妥一些。第二天：【实验材料准备】： 1000ul、200ul、20ul移液器，大、中、小号tip，1.5ml EP管。【实验仪器准备】： 台式低温离心机，旋转混匀仪，层析柜，水浴锅（调节水浴锅温度到65备用）。【实验试剂准备】：室温充分溶解1M NaHCO3。（一）、免疫复合物的沉淀及清洗。16、孵育过夜后，每管中加入60ulProteinAAgarose/SalmonSpermDNA。4旋转孵育1h。17、4静置10min后，4 30005000g离心1min。除去上清。18、依次用下列溶液清洗沉淀复合物。清洗的步骤：加入1ml洗涤液，在4旋转孵育3-5min，4静置2min沉淀，3000-5000g离心1min，除去上清。洗涤溶液*：a.low salt wash buffer-1次b.highsalt wash buffer-1次c.LiCl wash buffer-1次d.TE buffer-2次19、洗脱：洗脱液的配方：10ul20%SDS，20ul1MNaHCO3，170ulddH2O，共200ul。Input管加入200ul洗脱buffer，室温下备用；IP管加入100ul洗脱液，轻柔弹匀，室温孵育15min，离心（4 3000-5000g 1min）后，收集上清至新EP管。重复洗涤一次。最终的洗脱液为每管200ul。20、解交联*：每管中加入8ul 5M NaCl（NaCl终浓度为0.2M）。混匀，65解交联，时间4-5h或者过夜。（解交联后样本可冻存在-20备用）【实验补充及注意事项】： 1、头四次洗涤不要求完全弃上清，避免反复及不必要的样本丢失，最后一次要求尽量去除干净上清。 2、虽然说明书上说4小时已经足够，但是建议解交联过夜。因为在那样环境里，DNA不会降解，过夜解交联更充分些。注意在EP管口封上封口膜（避免样本蒸干）。 第三天：【实验材料准备】： 1000ul、100ul、200ul、20ul移液器，大、中、小号tip，1.5ml EP管。【实验仪器准备】： 台式低温离心机，水浴锅（调节水浴锅温度到37备用）。【实验试剂准备】：充分解冻RNaseA、蛋白酶K，准备足量0.5MEDTA及1MTris.HC，CHIP配套DNA回收试剂、收集管、吸附柱，或者Promega回收试剂盒A9281，95%乙醇，漂浮板。（一）、DNA样品的纯化回收21、解交联结束后，每管加入1ul RNaseA，37孵育30min。22、每管加入4ul 0.5MEDTA，8ul1MTris.HCl，1ul蛋白酶K（可预先配成mix）。水浴锅45处理1-2h。23、DNA片段的回收Millipore：a. 每管加入1ml 结合试剂A（5:1体积），混匀，终体积1200ul。 b. 将样本与结合试剂混合液分两次转移至吸附柱（吸附柱放置在收集管内），每次600ul，离心（10000-15000g 30s）弃下清。 c. 500ul 洗涤试剂B洗涤吸附柱，离心（10000-15000g 30s）弃下清。 d. 空离（10000-15000g 30s）后，将吸附柱转移至新收集管。 e. 向吸附柱中央吸附膜上滴加50ul洗脱试剂C，离心（10000-15000 30s），弃吸附柱，收集管内洗脱液即为纯化回收的DNA样本，可以冻存在-20供后续分析。promega胶回收试剂盒：a. 第一次打开试剂盒时，MWS中加入95%乙醇，加入体积请参照瓶上的标签。b. 加等倍体积的MBD至胶中（胶体350mg，点离；c. 55-65C水浴10分钟，水浴过程中每隔2-3分钟振荡EP管一次，以帮助凝胶溶解；d. 将SV微型柱置于2ml的收集管中，待上一步的所有液体冷却至室温后，将其加入离心柱中，室温孵育1min，13,000rpm离心1分钟；e. 弃掉废液，将离心柱放回收集管中；f. 向离心柱中加入700ul的MWS，13,000rpm离心1分钟，倒掉废液，将离心柱放回收集管中；g. 向离心柱中加入500ul的MWS，13,000rpm离心5分钟； h. 倒掉废液，将离心柱放回收集管中， 13,000rpm再离心2分钟；i. 将离心柱放入干净的1.5mlEP管中，室温干燥2分钟，再向离心柱的膜中央悬空滴加50ul的无酶水，室温孵育1分钟后，13,000rpm离心1分钟，所得液体即为纯化的PCR产物。j. 将上述所得液体重新悬空滴加至离心柱膜中央，室温孵育1分钟后13,000rpm离心1分钟。k. 纯化后的PCR产物于-20C保存。【实验补充及注意事项】;1、样品中SDS样品较高，普通的PCR产物回收试剂盒回收，很有可能会在最终的样品中混入SDS，影响PCR实验结果。小Tip：过柱前，在样品中加入一定量的异丙醇，能有效的消除SDS沉淀（网络意见尚未验证）。实验结果分析【CHIP-qPCR】：假设对照组S1，实验组S2计算如下：Input Dilution Factor=100（fraction of the input chromatin saved) -1 (-1次方)）% InputNormalized (S1)：1） Ct normalized ChIP (S1)= (Ct ChIP - (Ct Input -Log2 (Input Dilution Factor) Ct normalized ChIP (IgG/NIS)= (Ct ChIP - (Ct Input -Log2 (Input Dilution Factor)2）% InputAntibody = Log2 (-Ct normalized ChIP) % InputIgG/NIS = Log2 (-Ct normalized ChIP)3）%InputNormalized (S1)= % InputAntibody - % InputIgG/NIS% InputNormalized (S2)计算：1)Ct normalized ChIP (S2)= (Ct ChIP - (Ct Input -Log2 (Input Diluti