常用流动相的紫外截止波长.ppt

液相色谱分析 分析方法建立的实例 有机污染物的影响 一 50ml超纯水的有机物污染状态 液相色谱分析 分析方法建立的实例 有机污染物的影响 二 三蒸水 有大量的有机污染物不适合梯度分析 液相色谱分析 分析方法建立的实例 有机污染物的影响 三 典型的 实验室水 有大量的有机污染物不适合高灵敏度梯度分析 液相色谱分析 分析方法建立的实例 梯度方法开发实例 第一步 开发一个有9个烷基苯酮化合物的梯度方法 用C18柱 在最初的条件下 0 100 水 乙腈 分离不理想 整个色谱峰组保留时间太长 分离度也不好 液相色谱分析 分析方法建立的实例 梯度方法开发实例 第二步 为使色谱峰前移 提高起始时乙腈的比例 50 100 水 乙腈 分离得到改善 但是9个化合物出了10个色谱峰 说明有杂质存在 很可能是流动相水中的 液相色谱分析 分析方法建立的实例 梯度方法开发实例 第三步 从空白梯度图显示 在同样的色谱条件 同样的检测灵敏度下 共有两个杂质峰 说明流动相水中的杂质在此条件下可能会对检测有影响 液相色谱分析 分析方法建立的实例 梯度方法开发实例 第四步 空白梯度图同样品的色谱图进行对照后 我们看到杂质 共两个峰 中的第一个小峰对第8个色谱峰有干扰 会使其定量分析结果不准确 液相色谱分析 分析方法建立的实例 梯度方法开发实例 第五步 根据 梯度曲线下的面积越大 洗脱能力越强 的规律 试用 5曲线使3 9号峰提前 曲线5 50 100 B 但是小峰仍没有分出来 液相色谱分析 分析方法建立的实例 梯度方法开发实例 第六步 根据 梯度曲线下的面积越大 洗脱能力越强 的规律 试用 5曲线使3 9号峰提前 改用50 95 B见到好的现象 液相色谱分析 分析方法建立的实例 梯度方法开发实例 第七步 最后用50 90 B 曲线4 得到好的结果 液相色谱分析 液相色谱的检测模式 灵敏度 选择性 适应能力 液相色谱分析 开发液相色谱分析方法 分辨率是色谱分析中主要考虑的因素 在开发色谱方法时 有很多因素是很重要的 除分辨率之外 以下因素都要考虑 1 灵敏度5 成本2 载样量6 容易使用3 分析速度7 色谱柱寿命4 溶剂消耗8 效率 液相色谱分析 液相色谱分析方法的建立1 建立液相色谱分析方法通常有以下几步 1 分子量 在样品预处理或GPC分析时有用 2 选择合适的液相色谱方法 正相 反相或其他 3 选择合适的色谱柱 4 溶解度 选择流动相的条件 5 官能团 有否离子化基团 保留特性如何 6 样品的基质 考虑是否要前处理 如何前处理 液相色谱分析 液相色谱分析方法的建立2 续前一页 7 选择合适的K 值的条件 8 选择良好的峰位 a值 9 选择良好的色谱柱条件 N值 10 检测特性 是否有紫外吸收 荧光 11 用实测样品解决出现的特殊问题 12 证实方法的正确性 液相色谱分析 选择液相色谱的方法 主要液相色谱方法特性 液相色谱分析 选择液相色谱的方法 次要液相色谱方法特性 液相色谱分析 液相色谱的保留 保留时间tR的初步估计 保留时间tR 死时间t0 1 峰容量因子k 峰的容量因子k 保留时间tR 死时间t0 死时间t0t0 0 5Ld2左式中 t0 进样峰的出峰时间tR t0 1 k tR 峰的保留时间L 柱长 cm k tR t0 t0d 柱内径 cm k 峰的容量因子 液相色谱分析 反相色谱不同配比流动相与容量因子值 液相色谱分析 溶剂强度 改变流动相的组成或溶剂的强度 就可以改变K 和tR 在一定的条件下 减少保留时间或缩短分析时间的溶剂 小tR和K 值 为强溶剂 增加或延长分析时间的溶剂 大tR和K 值 为弱溶剂 例如 在反相色谱中 水是弱溶剂 在甲醇 水为流动相的系统中增加甲醇的比例 流动相变强 液相色谱的溶剂由弱到强排列的顺序为 正己烷 氯仿 二氯甲烷 甲基叔丁醚 乙醚 四氢呋喃 乙酸乙酯 乙腈 丙醇 甲醇 在反相色谱中有机溶剂增加10 左右 tR和K 值要减少2 3倍 液相色谱分析 峰位的重排 在分析多组分样品时 仅改变流动相的强度 组成百分比 而不改变其组成 一般仅仅改变所有组分的tR 不会发生峰位重排 在反相色谱中 下列条件改变可能发生峰位重排 1 流动相中换了强溶剂种类 2 pH值的改变 3 柱填料的改变 4 柱温的改变 5 流动相组成的改变 如加入离子对试剂三乙基胺等 液相色谱分析 液相色谱压力计算 0 46内径柱 式中L 柱长e 流动相粘度F 流速 mL mindc 柱内径 cmdp 柱填料直径 um 反相色谱常用流动相的粘度值 mPa s 25 下表红线框内的数字即为该溶液与水混合后的粘度 在25 时 即e 液相色谱分析 实验室常备的流动相和固定相 为满足液相色谱的方法选择 实验室应该常备以下的流动相和固定相 1 流动相 甲醇 乙腈 纯水 四氢呋喃 正己烷二氯甲烷 这些溶剂基本上能满足90 以上的液相色谱分离问题 2 固定相 C18键合相柱 硅胶柱 氰基柱合氨基柱 几点注意事项 色谱柱和流动相确定以后 为想获得满意的色谱分离 可进一步选择柱长 填料粒度和流速等 需要指出的是某些样品在进样前要进行很完全的样品预处理 另外 许多样品则需要梯度洗脱 当色谱条件有所改变时 需要寻找更合适的分离条件 液相色谱仪的使用 流动相及储液器 1 尽量使用HPLC级的溶剂与试剂 2 最好使用专用的溶剂瓶来放置流动相3 改变流动相时防止交叉污染 4 不要使用陈旧的流动相 5 定期更换流动相储液瓶 6 定期清洗烧结不锈钢吸滤头 7 定期清洗烧结不锈钢吸滤头 液相色谱仪的使用 对流动相的要求 由于高效液相色谱中流动相是液体 它对组分有亲和力 并参与固定相对组分的竞争 因此 正确选择流动相直接影响组分的分离度 对流动相溶剂的要求是 1 溶剂对于待测样品 必须具有合适的极性和良好的选择性 2 溶剂要与检测器匹配 对于紫外吸收检测器 应注意选用检测器波长比溶剂的紫外截止波长要长 所谓溶剂的紫外截止波长指当小于截止波长的辐射通过溶剂时 溶剂对此辐射产生强烈吸收 此时溶剂被看作是光学不透明的 它严重干扰组分的吸收测量 液相色谱仪的使用 对流动相的要求 3 高纯度 由于高效液相灵敏度高 对流动相溶剂的纯度也要求高 不纯的溶剂会引起基线不稳 或产生 伪峰 痕量杂质的存在 将使截止波长值增加50 1OOnm 4 化学稳定性好 不能选与样品发生反应或聚合的溶剂 5 低粘度 若使用高粘度溶剂 势必增高压力 不利于分离 常用的低粘度溶剂有丙酮 乙醇 乙晴等 但粘度过于低的溶剂也不宜采用 例戊烷 乙醚等 它们易在色谱柱或检测器内形成气泡 影响分离 液相色谱仪的使用 常用流动相的紫外截止波长 液相色谱仪的使用 常用流动相的强度参数 液相色谱仪的使用 设备和材料 溶剂过滤器 真空泵 0 45u或更细的水性滤膜和有机滤膜过滤的方法 用加了滤膜的溶剂过滤器和真空泵抽滤过滤的目的 除去溶剂中的微小颗粒 避免堵塞色谱柱 尤其是使用无机盐配制的缓冲液 必须做 溶剂和水的前处理 过滤 液相色谱仪的使用 设备和材料 超声波清洗机脱气的目的 除去流动相中溶解或因混合而产生的气泡气泡对测定的影响 1 柱流量不准2 检测器基线波动脱气注意点 1 每天脱气 无在线脱气器时 2 混合溶剂脱气时间不能过长 必须做 溶剂和水的前处理 脱气 液相色谱仪的使用 自动进样器手动进样器原理 六通阀注入方式 1 全量注入2 部分注入 进样器 样品装填状态 LOAD 手动进样器原理图 注射状态 INJECT 液相色谱仪的使用 分析结果重现性好提高柱效降低柱压保证检测稳定性 柱温控制的优点 使用柱温箱 液相色谱仪的使用 高压输液泵 1 每次使用后要把泵中的含盐缓冲液洗干净 防止盐的沉积 泵要浸在无缓冲液的溶液或有机溶剂中 2 使用HPLC级的流动相试剂 3 使用不锈钢烧结吸液滤头 4 用纯水或双蒸蒸馏水 流量3 5ml 分 冲洗15分钟 冲洗时必须打开排放阀 逆时针拧松 必须做 使用输液泵的注意事项 液相色谱仪的使用 高压进样阀 必须做 每次使用后要冲洗干净进样阀中残留的样品和缓冲盐 防止无机盐沉积和样品微粒磨损阀转子 冲洗方法见进样阀说明书 严禁用 严禁使用气相色谱那样的尖头针进样 根据情况定在注射针前加装针式过滤器 防止样品中的微粒进入进样阀 液相色谱仪的使用 液相色谱柱 1 流动相或溶剂的化学腐蚀性不能太强 2 避免样品微粒在柱头沉积 3 防止过高压力冲击色谱柱 4 流动相pH大于7时要使用保护柱 5 正确制备样品 在样品注射器前加装针式过滤器 6 色谱柱不用卸下前 a 必须洗去缓冲液 b 防止产生微生物c 用大于10 的有机溶剂充满整个色谱柱 d 柱卸下后用柱堵头将色谱柱首尾密封 液相色谱仪的使用 紫外检测器 每次做1 流过池每次使用后连同色谱柱一起清洗 2 使用脱过气的流动相 防止气泡卡在流过池内 经常做3 不定期的用强溶剂反向冲洗流过池 拆开柱子 4 不定期的使用空流过池校正波长 根据情况定5 在流过池出口加装背压阀 液相色谱仪的使用 操作极限预防 1 严禁在无流动相时启动高压输液泵 2 设定泵的上限压力 25Mpa 防止长期压力过高损坏泵和进样阀 3 设定泵的下限压力 0 5 1Mpa 防止流动相抽干和严重泄漏 液相色谱仪的使用 整台液相色谱仪的维护 1 在使用过含盐缓冲液后必须清水冲洗泵15分钟 此时必须打开排放阀 不能使废液进入色谱柱 2 关上排放阀 用90 10 的水 甲醇溶液冲洗整个系统 时间为15 20分钟 流量1ml 分 本步骤主要是冲洗干净系统内其他含盐的部位 3 用纯的强溶剂冲洗整个系统 时间为1小时 流量为1ml 分 本步骤主要是保护色谱柱 4 如果未使用缓冲液 上面1 2两步骤可免去 直接用纯的强溶剂冲洗整个系统 时间为1小时 流量为1ml 分 每次用过仪器后必须做 液相色谱仪使用中的问题 A 不进样时柱压连续升高 流动相有颗粒 流动相溶解性 流动相的不稳定性 聚合 形成柱死体积 与使用条件有关 B 进样时压力升高 样品有颗粒 样品在流动相中不溶 样品组分与固定相不兼容 压力问题 液相色谱仪使用中的问题 A 所有峰都向低保留值方向漂移 酸 碱 中性化合物 键合相流失 流动相不稳定 可能性较小 溶剂输送系统 流速变化 B 所有峰都向高保留值方向漂移 在水 有机溶剂的混合体系中 有机溶剂含量减少 柱改变 可能性较小 溶剂输送系统 流速变化 C 离子型化合物的色谱峰的保留值漂移 流动相中挥发性组分损失 离子强度 pH漂移 柱改变 键合相或污染 保留值漂移 液相色谱仪使用中的问题 A 与流动相有关的问题 使用新鲜的流动相B 与色谱柱有关的问题 测试新柱 用标准的测试混合样测试新柱 清洗 色谱柱后再测 考虑样品基质与使用条件对柱稳定性的影响 保留值漂移 液相色谱仪使用中的问题 预柱与保护柱 从泵来的流动相 预柱 进样器 保护柱 分析柱 到检测器 预柱对流动相而言 保护柱对色谱柱而言 液相色谱仪使用中的问题 良好的柱使用规范 在使用前过滤溶剂完全润湿在运输中变干的色谱柱了解溶剂对样品的溶解性及对分离的影响对含有保留性较强的杂质组份的样品进行预处理注意柱子的pH使用范围定期用强极性的溶剂清洗色谱柱储存色谱柱时要冲尽缓冲液 并用有机溶剂饱和柱子避免外力损伤色谱柱 如弯曲 跌落等 液相色谱仪使用中的问题 使用保护柱 带整体过滤片的Techtron保护柱 液相色谱柱维护 色谱柱压力升高原因1 溶剂中的不溶物 应使用色谱纯溶剂 膜过滤 孔径不超过0 45 m 原因2 样品中的不溶物 应对样品进行膜过滤 孔径不超过0 45 m 原因3 泵 进样器等中的不溶物 在泵和进样器之间安装内置过滤器 在进样器和柱之间安装预过滤器原因4 柱内不溶物的形成4 1 由于溶剂的不互溶而产生的沉淀 用能溶解沉淀物的溶剂冲洗色谱柱4 2 在不互溶溶剂中由于进样而产生的沉淀 检查样品液和流动相是否互溶4 3 由于温度的改变或固定相的干涸而产生的沉淀 将色谱柱密封紧 并保持室温恒定 液相色谱柱维护 操作压力上升故障排除HPLC系统流程图 吸入过滤器 泵 内置过滤器 外置过滤器 进样器 保护柱 主分析柱 检测器和排放系统从流程图的末端依次断开部件 如从检测器开始断开 最容易引起阻塞的部件是 外置过滤器 保护柱和主分析柱 注 应记录新柱子在常规分析条件下的操作压力 液相色谱柱维护 柱堵塞的修复u步骤1 使用含盐缓冲液后 如离子对试剂 应用溶解性强的溶剂 如水 进行冲洗u步骤2 先断开检测器 然后用对来自样品中的物质有强溶解性的溶剂进行冲洗 对于反相色谱柱 可使用甲醇 乙睛四氢呋喃 氯仿 庚烷等 在此条件下 应避免溶剂的pH低于2或高于8若经过步骤1和步骤2后 压力仍没下降至步骤3u步骤3 断开检测器 将色谱柱反方向放置 然后检查柱压 1 若压力稳定下降 至步骤4 2 若压力不下降 至步骤5 u步骤4 保持色谱柱反方向连接 用低于0 5ml min流速冲洗