升麻炮制前后有效成分的比较研究.doc

升麻炮制前后有效成分的比较研究 周保琪 2009级中药传承班 河南中医学院 河南郑州 450008摘要 目的:建立测定升麻中有效成分阿魏酸和异阿魏酸含量的方法,并比较炮制前后阿魏酸、异阿魏酸和272脱氧升麻亭的含量差异。方法:阿魏酸和异阿魏酸测定方法:色谱柱为YMC2Pack ODS2C18柱(4. 6 mm 150 mm, 5m) ,乙腈2水2乙酸(15 85 0. 25)为流动相,流速0. 6 mL /min,柱温26 C,紫外检测波长320 nm; 272脱氧升麻亭测定方法:色谱柱为YMC2Pack ODS2C18柱(4. 6 mm 150 mm, 5m) ,乙腈2水2乙酸(40 60 1)为流动相,流速0. 6 mL /min,柱温26 C,示差检测器。结果:测定阿魏酸线性范围( r) ,加样回收率为(RSD ) ;异阿魏酸线性范围( r ) ,加样回收率为 (RSD ) 。结论该方法简便、快捷、准确,重复性好,适合于升麻药材和饮片的质量控制。关键词 升麻; 阿魏酸; 异阿魏酸; 272脱氧升麻亭; 炮制升麻为常用中药,具有发表透疹、清热解毒、升举阳气等功能, 2010年版中国药典收载其原植物有大三叶升麻Cim icifuga heracleifolia Kom. 、兴安升麻C. dahuricaMaxim. 和升麻C. foetida L. 3种。升麻根茎主要含三萜皂苷、有机酸和色原酮类化合物。一般认为升麻有机酸是其有效成分,并以所含的阿魏酸、异阿魏酸为指标控制质量 14 。近年来研究发现升麻所含的环菠萝蜜烷型三萜皂苷具有抗肿瘤、抑制核苷运转、调节内分泌等多种生理活性,也是其活性成分之一。升麻的临床应用以生片和蜜制片为主,有关升麻炮制研究非常少,本实验将以RP2HPLC法对升麻炮制前后有效成分阿魏酸、异阿魏酸和三萜皂苷272脱氧升麻亭(272deoxyactein)的含量进行测定,并探讨升麻炮制前后有效成分变化规律。1升麻炮制前后阿魏酸和异阿魏酸的含量测定1. 1仪器与试药日本Jasco 系列HPLC 色谱仪: Jasco pump21580, Jasco UV21575 检测器, Jasco 工作站; 湘仪天平厂生产TG332A微量分析天平,昆山市超声仪器有限公司生产KQ2250B型超声波振动仪。乙腈色谱纯( Fisher公司出品) ,重蒸馏水自制,阿魏酸对照品由中国药品生物制品检定所提供(批号077329910) ,异阿魏酸和272脱氧升麻亭为本课题组分离和结构鉴定, 经HPLC 法检测含量达98 。1. 2实验方法1. 2. 1色谱条件色谱柱为YMC2Pack ODS2C18柱(4. 6 mm 150mm, 5m) ;乙腈2水2乙酸(15 85 0. 25)为流动相,流速0. 6 mL /min,柱温26 C, 紫外检测波长320nm,进样量20L,外标法定量。理论塔板数按阿酸峰计算,应不低于4 000。1. 2. 2溶液制备对照品溶液制备准确称取干燥至恒重的对照品阿魏酸2. 12 mg置2 mL 量瓶中,用80 甲醇溶解并稀释至刻度,摇匀即得1. 06 mg/mL 阿魏酸贮备溶液;另再准确称取干燥至恒重的对照品异阿魏酸2. 08 mg置2 mL 量瓶中,用80 甲醇溶解并稀释至刻度,摇匀即得1. 04 mg/mL 异阿魏酸贮备溶液。供试品溶液的制备精密称取干燥的升麻样品粉末0. 5 g,置三角瓶中,加入50 mL甲醇,摇匀,于80 C水浴上回流提取40min,过滤,滤渣用20 mL甲醇洗涤3次,合并滤液,回收甲醇,提取物用80甲醇定容至2 mL量瓶,摇匀,即得。1. 2. 3测定法精密吸取阿魏酸和异阿魏酸贮备液80 L 和160L置2 mL量瓶,用80 甲醇定容至刻度,即为阿魏酸和异阿魏酸稀释溶液。用微量进样器精密吸取供试品溶液和对照品稀释溶液各20 L 注入HPLC仪,外标法定量，得到对照品、样品HPLC色谱图,测定结果见表1。表1升麻炮制前后有效成分含量测定药名 产地 类别 阿魏酸含量 异阿魏酸含量 27脱氧升麻亭含量 （g） (g） (g） 升 甘肃 生药 切片 蜜制片麻 四川开源 生药 切片 蜜制片 兴安升麻炮制前后有效成分含量测定药名 产地 类别 阿魏酸含量 异阿魏酸含量 27脱氧升麻亭含量 （g） (g） (g） 兴 内蒙 生药 安 切片升 蜜制片麻 牡丹江 生药 切片 蜜制片 河北承德 生药 切片 蜜制片1. 3方法学考察1. 3. 1稳定性试验取同一供试品溶液按上述色谱条件分别于0,1, 2, 4, 6, 10 h进样测定,预测结果表明含量在10 h内基本不变。1. 3. 2线性关系考察分别精密吸取阿魏酸贮备溶液20, 40, 80, 120,160L置1 mL量瓶,加80 甲醇稀释至刻度,按上述色谱条件进行HPLC分析。以峰面积对进样量进行回归处理,得阿魏酸线性回归方程 , r,线性范围;另精密吸取异阿魏酸贮备液20, 40, 60,80, 100L置1 mL量瓶,加80 甲醇稀释至刻度,按上述色谱条件进行HPLC分析。以峰面积对进样量进行回归处理,得异阿魏酸线性回归方程 , r ,线性范围。1. 3. 3重复性试验取同一批药材5份,按供试液制备并测定。计算结果阿魏酸和异阿魏酸的RSD 。1. 3. 4精密度试验取阿魏酸和异阿魏酸贮备液各40L 置1 mL量瓶,加80 甲醇稀释至刻度,按上述色谱条件进行HPLC分析,连续测定5次,每次进样20L,计算阿魏酸峰面积的RSD , 异阿魏酸RSD 。1. 3. 5回收率试验精密称取已知含量生药样品(四川开源产)约0. 25 g共5份,分别加入阿魏酸(1. 02 mg/mL)和异阿魏酸( 1. 05 mg/mL)对照品溶液40, 80 L,待溶剂挥干后,按供试液制备并测定。取5次测定的平均值计算回收率( n = 5) ,计算结果阿魏酸和异阿魏酸加样回收率(RSD ) 。2升麻炮制前后272脱氧升麻亭的含量测定2. 1仪器与试药日本Jasco 系列HPLC 色谱仪: Jasco pump21580, Jasco Ri21575示差检测器, Jasco工作站;湘仪天平厂生产TG332A微量分析天平,昆山市超声仪器有限公司生产KQ2250B型超声波振动仪。乙腈色谱纯( Fisher公司出品) ,水为重蒸馏水,对照品272脱氧升麻亭由作者分离,经红外、质谱和核磁共振鉴定结构, HPLC法进行纯度检查,面积归一法大于98 。升麻样品由作者采集并鉴定学名。2. 2方法2. 2. 1色谱条件色谱柱为YMC2Pack ODS2C18柱(4. 6 mm 150mm, 5m) ;乙腈2水2乙酸(40 60 1)为流动相,流速0. 6 mL /min,柱温26 C,示差检测器,进样量20L,外标法定量。理论塔板数按272脱氧升麻峰亭计算,应不低于3 500。2. 2. 2试液的制备供试液制备精密称取样品粉末2 g,置磨口圆底瓶中,加入甲醇80 mL 于水浴中加热回流,提取60 min,滤出提取液,残渣同法再提取1次,将滤液合并,回收溶剂。将此提取物以甲醇(色谱纯)溶解,并定容至5 mL 量瓶,摇匀,即得。过0. 45 m的微孔滤膜,作供试品溶液。对照品溶液制备精密称取干燥至恒重对照品2. 07 mg置2 mL 量瓶,加甲醇溶解并定容至刻度,摇匀即得1. 035 mg/mL对照品溶液。2. 2. 3样品测定精密吸取对照品溶液10, 20L和供试品溶液20L,分别注入HPLC仪,外标法定量对，得到照品、样品HPLC色谱图。测定结果见表1。3讨论3. 1检测波长和检测器的确定对阿魏酸和异阿魏酸甲醇溶液在200400 nm范围内进行紫外光谱扫描,阿魏酸和异阿魏酸的最大吸收波长分别为313和320 nm,故选择320 nm作检测波长。由于272deoxyactein无紫外吸收,只能用示差或蒸发光散射检测器进行测定,本研究选择示差检测器。3. 2供试液制备方法的确定测定阿魏酸和异阿魏酸的含量时,考察了不同提取溶剂(甲醇、50 甲醇和水) 、不同提取方法(超声波提取和加热回流提取)及不同提取次数,预测结果表明,以甲醇作溶剂,加热回流提取阿魏酸和异阿魏酸的含量较高。3. 3升麻炮制后阿魏酸和异阿魏酸变化的探讨预测结果：升麻切制和蜜制以后,阿魏酸和异阿魏酸含量均有所增高,且蜜制片比切片含量增加更多。从HPLC色谱图上,可看出升麻炮制前后色谱图差异较大,有些色谱峰面积增大,而有些色谱峰面积减小。我们在作升麻化学成分研究时,发现升麻酚酸类化合物多以酸酯的形式存在,可能在炮制过程中,其酸酯类成分水解生成有机酸和醇类,使阿魏酸和异阿魏酸含量增加。3. 4升麻炮制后272脱氧升麻亭变化的探讨预测结果：升麻炮制前后272deoxyactein的含量略有降低,可能是炮制后,样品中含有一定量的蜂蜜,使272de2oxyactein的含量相对降低,但炮制前后的色谱指纹图无变化,说明升麻炮制对其三萜类成分影响不大。预测结论：该方法简便、快捷、准确,重复性好,适合于升麻药材和饮片的质量控制参考文献 1 中国药典2010年版一部 S. 2010: 50. 2 潘