微生物资源及开发利用.ppt

微生物资源及开发利用 山东省农业科学院岳寿松2011 6 12威海 第三届特种医学暨三省省际联合 山东 河南 湖北 微生态学学术会议 提要 肠道微生物资源从极端微生物到太空微生物废弃资源的微生物转化 肠道微生物 人类肠道细菌超1000万亿细菌数量是人体细胞的10倍 PLoSbiology November2008 11 6 280LesDethlefsenDavidA Relmanetal 斯坦福大学医学院的戴维 雷尔曼 DavidRelman 和同事一起 利用一种新型技术 焦磷酸测序法 pyrosequencing 得到了关于人体肠道内菌落数量更为准确的数据 PLoSbiology 人类肠道内的细菌群落数量是原有认识的10倍以上 Science328 228 2010 MatamVijay Kumaretal micegeneticallydeficientinToll likereceptor5 TLR5 acomponentoftheinnateimmunesystemthatisexpressedinthegutmucosaandthathelpsdefendagainstinfection exhibithyperphagiaanddevelophallmarkfeaturesofmetabolicsyndrome includinghyperlipidemia hypertension insulinresistance andincreasedadiposity MetabolicSyndromeandAlteredGutMicrobiotainMiceLackingToll LikeReceptor5 肠道微生物系变化导致代谢综合症 肠道微生物可能影响人类的健康 如胖瘦 糖尿病 胃病 甚至癌症 缺乏先天性免疫系统中的某种重要成分 TLR5蛋白 的小鼠会产生代谢综合症的标志性特征 如伴有肠道微生物系变化的脂肪积聚的增加及胰岛素抵抗 将突变小鼠的肠道内微生物转移到无菌小鼠的肠道之中会使接受这些微生物的小鼠出现代谢综合症的几种特征 人肠道微生物菌落基因目录 JunjieQin RuiqiangLietalAhumangutmicrobialgenecatalogueestablishedbymetagenomicsequencing Nature Vol464 4March2010 theIllumina basedmetagenomicsequencing assemblyandcharacterizationof3 3millionnon redundantmicrobialgenes derivedfrom576 7gigabasesofsequence fromfaecalsamplesof124Europeanindividuals Thegeneset 150timeslargerthanthehumangenecomplement Over99 ofthegenesarebacterial indicatingthattheentirecohortharboursbetween1 000and1 150prevalentbacterialspeciesandeachindividualatleast160suchspecies 124位健康的 超重的和肥胖的成年人以及炎症患者提取的人肠道微生物菌落的基因目录 比人类基因组大150倍 超过99 为细菌 这些基因大部分是在不同个体之间共享的 natureVolume 473 Pages 174 180Datepublished 12May2011 DOI doi 10 1038 nature09944 Enterotypesofthehumangutmicrobiome identifythreerobustclusters referredtoasenterotypeshereafter thatarenotnationorcontinentspecific Thisindicatesfurthertheexistenceofalimitednumberofwell balancedhost microbialsymbioticstatesthatmightresponddifferentlytodietanddrugintake Theenterotypesaremostlydrivenbyspeciescomposition butabundantmolecularfunctionsarenotnecessarilyprovidedbyabundantspecieshighlightingtheimportanceofafunctionalanalysistounderstandmicrobialcommunities individualhostpropertiessuchasbodymassindex age orgendercannotexplaintheobservedenterotypes 人类肠道微生物系统可拥有特定的分类 肠型 肠型分三类 Enterotype1 Enterotype2 Enterotype3 分别为Bacteroides型 Prevotella型和Ruminococcus型 未来医师或可依据肠型的区划 量身打造病患饮食清单以及开处方 甚至至为抗生素寻求替代品 肠型与种族 性别 体重 健康或年龄等均无关联 ThinkTwice HowtheGut s SecondBrain InfluencesMoodandWell Being AdamHadhazy February12 2010 Acomplex independentnervoussystemlinesthegastrointestinaltractthathasbeendubbedthe secondbrain 心理过程与消化系统紧密相联的程度超出人们的想象 长期压力过大 过度紧张 焦虑 抑郁 易怒等不良情绪 均可使胃肠道生理功能发生紊乱 患老年性痴呆症及帕金森氏病的病人中 常在头部和腹部发现同样的组织坏死现象 疯牛病病人通常是大脑受损而出现精神错乱 与此同时肠器官也经常遭到极度损害 natureVol467 2September2010 doi 10 1038 nature09354 Bacterialcharityworkleadstopopulation wideresistanceHenryH Lee MichaelN Molla CharlesR Cantor JamesJ Collins Apopulation basedantibiotic resistancemechanisma Intheabsenceofantibioticstress wild typecellsnaturallyproduceindole b Underantibioticstress wild typecellsstopproducingindoleandeventuallydie c Whenadrug resistantmutantemerges itisabletoproduceindoleevenunderantibioticstress Thisindoleallowsthemorevulnerablecellsinthepopulationtosurvivetheantibioticstress byinducingvariousantibiotic tolerancemechanisms therebyboostingthesurvivalcapacityofthepopulation 单细胞组成的群体在种程度上可以像多细胞一样运转 极端环境微生物 太空微生物 征召细菌进行太空 生物开采 为将来月球或火星殖民者提炼氧气 营养物质和矿物质 最有可能的太空 拓荒者 蓝细菌cyanobacteria 又称为蓝绿藻 适应了地球一些最极端的环境 从极度寒冷干旱的南极麦克多默干燥谷 AntarcticMcMurdoDryValleys 到炎热干旱的阿塔卡马沙漠 AtacamaDesert 意味着其也许有能力在严酷的外太空存活下来 微型矿工将为人类在外星球蓬勃发展助一臂之力 Useofcyanobacteriaforin situresourceuseinspaceapplicationsPlanetaryandSpaceScienceVolume58 Issue10 August2010 1279 1285 太空微生物 PlanetaryandSpaceScienceVolume58 Issue10 August2010 1279 1285Useofcyanobacteriaforin situresourceuseinspaceapplications KarenOlsson Francis CharlesS Cockell将几种细菌发射到高度300千米的近地轨道 让它们连续暴露在真空 寒冷 炎热和辐射环境中 接着在有水的情况下把这些细菌接种到不同类型的岩石中 包括类似于月球高地风化层的南非斜长岩 anorthosite 和类似于月球和火星风化层的冰岛火山玄武岩 柱胞鱼腥藻 Anabaenacylindrica 生长最快 萃取元素最多 还能经受住月球和火星的环境 因而成为最具太空潜能的细菌 废弃 角蛋白质 资源的微生物转化 近年来 随着分子生物学技术的发展与应用 角蛋白酶研究进展迅速 特别是角蛋白酶降解疯牛病的致病因子 Prion蛋白 的发现 使之成为研究热点 由于Prion蛋白的 折叠构象与羽毛角蛋白类似 因此以羽毛角蛋白质为材料研究降解机理具有更重要价值和意义 Keratinasehasbeendiscoveredtodegradethe Prionprotein virulencefactorofmadcowdiseaseinrecentyears Featherkeratinhasaproteinstructuresimilartothatoftheprion It sarich sheetstructure similartothepathogenicunfoldedisoformofprions 降解羽毛微生物分离及多样性研究 30个样本746个具有分解蛋白质微生物菌落130株具降解羽毛的能力得到了枯草芽孢杆菌 Bacillussublitis YYW 1 NKY 12 嗜麦芽窄食单胞菌 Stenotrophomonasmaltophilia YHYJ 1 NKY 3 NKY 4 NKY 5 NKY 6和NKY 7 产气单胞菌属Aeromonassp NKY 13 微杆菌属Microbacteriumsp JJD 1 芽孢杆菌属Bacillussp JJD 2 金黄杆菌属Chryseobacteriumsp JJD 3等属和种的18株高效菌株 BacillussublitisYYW 1菌株及芽孢 10000 S maltophiliaYHYJ 1 10000 Microbacteriumsp JJD 1 至少有5株为S maltophilia 40 说明S maltophilia羽毛废弃物分解菌中优势种群 一个典型样品 有42株菌具有分解羽毛的能力 其中13株分解羽毛能力很强 分属于3个以上的属 说明降解羽毛微生物系统发育的多样性 Thenativekeratinaseshowedstrongdegradingcapabilityonfeather woolandhair Featherandwoolweredegradedcompletelyat36hand72hafterinculatedwiththekeratinase respectively andhairwasdegradedobviouslyat84h B1 B2 C2 0hHair84h 0hFeather36h 0hWool72h 野生菌接种于羽毛 羊毛 毛发三种培养基 观察对三种底物的降解情况 36小时能将羽毛完全降解 72小时将羊毛完全降解 84小时后对头发有明显降解 StudiesonfeatherdegradatingandkeratinasepropertiesofS maltophiliaYHYJ 1 嗜麦芽窄食单胞菌菌YHYJ 1角蛋白酶KerF基因克隆 表达 纯化及酶学性质分析 ProteincontentinfermentedliquidProteinconcentrationwasdeterminedaccordingtoBradford 1976 usingbovineserumalbumin BSA asstandardsubstrate 发酵液蛋白质含量 S maltophiliaYHYJ 1发酵产酶曲线 Timecourseproductionofkeratinaseinfeathersubstrate OptimumtemperatureandthermalstabilityofcrudekeratinaseTheoptimumtemperatureofcrudeenzymewas50 Andthekeratinasewasstableat40 45 角蛋白酶的最适反应温度及热稳定性 Effectoftemperatureonactivityofcrudekeratinase Temperaturestabilityofcrudekeratinase OptimumpHandpHstabilityofcrudekeratinaseTheoptimumpHofcrudeenzymewas9 0 TheactivityofkeratinasewasstableinthepH6 6and8 4indicatedthatitisacombinationenzyme 角蛋白酶最适pH值及pH值稳定性嗜麦芽窄食单胞菌角蛋白酶粗酶最适pH值为9 0 在pH8 4时比较稳定 同时在pH6 6时也相对稳定 由这两个峰可以初步推断此角蛋白酶可能为一种复合酶 EffectofpHonactivityofcrudekeratinase EffectofpHonstabilityofcrudekeratinase Cloning Expression PurificationandFunctionalAnalysisofS maltophiliaYHYJ 1keratinasegeneKerF ExpressionandPurification CloningofgeneKerF Functionalanalysisofkeratinase KerF基因克隆 表达纯化 酶活性质分析 嗜麦芽窄食单胞菌菌YHYJ 1角蛋白酶KerF基因克隆 表达 纯化及酶学性质分析 PrimerdesignP1 5 GAACGAACATTTCATCTTGCT 3 P2 5 GGTCTGAGGAACAGCGTG 3 DesigntheP3 P4withoutsignalpeptideaccordingtoexpressionvectorpET28a P3 5 AAACCATGGCTCAGGTAACGCAACC 3 Nco P4 5 AAAAAGCTTGTACTGGGCGTTGAGGGTC 3 HindIII 嗜麦芽窄食单胞菌R551 3全基因组已测序 基因组序列和注释已登陆GenBank 根据推定的嗜麦芽窄食单胞菌R551 3的角蛋白酶基因序列设计引物P1 P2 测序后针对pET28a 表达载体设计去信号肽引物P3 P4 ExtractionofgenomicDNAExtracttheDNAofStenotrophomonasmaltophiliaasthetemplateforfurtherPCR AgarosegeleletrophoresisofgenomicDNAofS maltophiliaYHYJ 1 嗜麦芽窄食单胞菌总DNA提取提取嗜麦芽窄食单胞菌的染色体DNA 作为下一步PCR扩增的模板 M Marker 1KbDNALadder 1 GenomicDNAofS maltophiliaYHYJ 1 PCRamplificationofkeratinasegeneandconnectionofthetargetgeneandT vector 角蛋白酶基因KerF的扩增及与T载体的连接 以S maltophiliaYHYJ 1的基因组DNA为模板 进行PCR扩增 得到一条大小为1980bp左右的特异性条带 连接后的重组质粒pMD18 KerF经EcoRI和HindIII双酶切后出现2条带 PCRamplificationofKeratinasegeneKerFM Marker DL2000Plus 1 KeratinasegeneKerF IdentificationofrecombinantplasmidpMD18 KerFbydigestion EcoRI HindIII SequencingandsignalpeptideanalysisofthetargetgeneThekeratinasegene KerF includecompletesequenceof1981bpanda1734bpopenreadingframeandencode580aminoacid wasclonedfromS maltophilia GenBankAccessionNo HM590650 UsingSignalP3 0toassaythesignalpeptideofKerFgene KerF基因序列测定与信号肽分析利用DNAman软件和NCBI的BLAST进行序列同源性分析 结果显示 该基因全长1981bp 含有一个1743bp的开放阅读框 编码580个氨基酸 将该基因提交GenBank 获得登录号HM590650 利用SignalP3 0软件分析推导氨基酸的信号肽 ConstructionofpET28 kerFrecombinantplasmid pET28 kerF重组质粒构建 PCRamplificationofKerFgenewithoutsignalpeptideandidentificationofrecombinantplasmidpET28 kerFbydigestion NcoI HindIII 去信号肽的KerF片段PCR扩增及与pET28表达载体的连接设计引物P3 P4在PCR时将KerF片段的信号肽切除 电泳检测后得到一段与预计结果大小一致的条带 1756bp 将KerF片段与pET28表达载体连接 提取转化子质粒 进行NcoI和HindIII双酶切鉴定 PCRamplificationofgeneKerFwithoutsignalpeptide IdentificationofrecombinantplasmidpET28 kerFbydigestion NcoI HindIII ExpressionofS maltophiliaKeratinaseGene KerF inEscherichiacoli 重组角蛋白酶的表达以重组质粒pET28 kerF转化大肠杆菌BL21 DE3 37 振荡培养1h至OD600约为0 1 25 0 1mmol LIPTG诱导表达 重组质粒pET28 kerF在相对分子量50kD处出现一条特异蛋白带 SDS PAGEanalysisoftheexpressionproductatdifferentinducedtimes 1 Marker 1 7 recombinantstraininducedbyIPTGat1 7h respectively 8 14 recombinantstrainlysateinducedbyIPTGat1 7h respectively PurificationofkeratinaseKerFRecombinantKerFwaspurifiedtoelectrophoreticalhomogeneityafternickelaffinitychromatographyandexhibitedahighspecificactivityof726U mg 重组角蛋白酶的纯化重组角角蛋白酶末端含有His标签 可采用镍亲和层析法快速纯化 对纯化的角蛋白酶进行蛋白含量测定和酶活测定 得出重组角蛋白酶比酶活力达到26U mg AnalysisofrecombinantexpressedkeratinasebySDS PAGE M Marker 1 purifiedkeratinase 2 recombinantstrainpET28 kerFlysateinducedbyIPTG OptimumtemperatureandthermalstabilityofkeratinaseKer Effectoftemperatureonenzymeactivity Effectoftemperatureonenzymestability KerF角蛋白酶的最适作用温度和温度稳定性在pH7 4 反应30min的条件下 于25 75 范围内 每隔5 分别测定酶活 以酶活最高为100 计算相对酶活 由此确定酶的最适作用温度 将酶液于30 35 40 45 50 55 下保温处理不同时间 测定残余酶活性 以未保温 4 放置 的酶样活性为100 由此确定酶的热稳定 OptimumpHandpHstabilityofkeratinasKerFTheoptimumpHwasdeterminedat30 usingthefollowingbuffers Aceticacid sodiumacetatebuffer pH4 2 5 4 Tris HC1buffer pH6 0 8 4 andGlycine NaOHbuffer pH9 0 9 6 Theenzymesolutionwaspreincubatedfor30minindifferentpHbuffer Thentheresidualactivitywasmeasured EffectofpHonenzymeactivity EffectofpHonenzymeactivity EffectofpHonenzymeactivity KerF角蛋白酶的最适pH值及pH稳定性 EffectofpHonenzymeactivity EffectofpHonenzymeactivity EffectsofpHonenzymeactivity EffectofpHonenzymestability EffectofpHonenzymestability Effectofmetalionsonkeratin