HE染色常见问题与对策.doc

HE染色常见问题与对策HE是最基本的也是最重要的病理学染色技术。一张质量上乘的HE切片是病理医生得以做出正确诊断的关键。许多所谓的“疑难病理案例”,大多数是由于制片质量差所造成的。制片质量差不仅在中小医院病理科会发生,有些大医院也会出现。因为, HE染色是一种多步骤、多因素决定的实验方法,无论是手工还是机器操作,都存在着许多影响因素,甚至会出现不理想的染色结果,从而导致误判和误诊。所以,除提高病理医生的诊断水平外,培训病理技术人员、提高技术人员的业务素质也是当务之急。本文对HE染色中常见的几个问题及其对策,进行分析与讨论如下。1切片在脱蜡后出现大片白色的斑点原因:由于烤(烘)片温度太低,玻片在脱蜡前没有充分烤(烘)干;切片在二甲苯停留时间不足,或二甲苯使用过久,造成脱蜡不尽。对策:如果玻片是由于没有烤(烘) ,先用无水乙醇处理去除玻片上的水分,然后重新用二甲苯脱去石蜡。如果烤(烘)干不足的现象比较严重,可能导致切片脱落,则无法补救。如果白色斑点是由于切片在二甲苯停留时间不足造成,或使用的二甲苯过久,切片则需退回到二甲苯停留时间相对长些,或更换二甲苯,脱色、漂白、重新染色。2细胞核染色苍白、暗淡,即苏木精染色太淡原因:此类问题可能有3个影响因素,切片在苏木精染色液停留时间太短;苏木精染色液过度氧化,失去染色能力,不能再继续使用;分化步骤处理时间过长。如果是骨组织细胞核暗淡,则多数是由于脱钙过度造成。对策:切片重新染色。如果组织在酸性固定液如Zenker、Bouin及非中性缓冲甲醛液固定时间过长,细胞核染色能力将减弱,须增加其在苏木精染色液的时间,或用一些方法增加组织的嗜碱性,以改善细胞核的着色。例如:建议上述组织切片最好使用Weigert铁苏木精染色液;如果组织是用Zenker液固定的,可将切片脱蜡后放在5%碳酸氢钠溶液34 h,流水冲洗5 min后染色;如果组织是用Bouin液固定的,可将切片脱蜡后放在5%碳酸锂1 h,流水冲洗10 min后染色。3细胞核过染,即苏木精染色太深,甚至苏木精染液的分布占据了细胞质的位置原因:此类问题可能有3个影响因素,即切片在苏木精染色液停留过长、切片太厚、分化步骤时间太短。对策:如果切片不是因为太厚(用显微镜仔细上下调节微调,只有一二层细胞核层次) ,脱色、漂白、重新染色,对于染色和分化时间做些适当的调整。如果确定是由于切片太厚导致的细胞核过染,则需要重新切片。4细胞核呈红、棕色改变原因:主要有苏木精染色液过度氧化和切片在苏木精染液染色后返蓝不足。对策:首先,每次染色之前检查苏木精染色液的染色能力,发现氧化过度应及时更换。其次,可用流水、温水或弱碱性溶液如稀氨水、0. 2%碳酸氢钠等,在苏木精染色后,给切片以足够的蓝化时间。5伊红着色淡原因:伊红染液的pH值可能大于5;也可能是蓝化液残留过多;切片太薄;或切片经伊红染色后在乙醇脱水时间过长。对策:检查伊红染液的pH值,如果必要的话,用乙酸将其调节在416510之间,从而使伊红染色色彩艳丽。确保每次蓝化步骤完成后,使用的弱碱性溶液被充分洗去,玻片上没有残留的弱碱性溶液。检查切片的厚度。脱水时不要让切片在低浓度乙醇停留时间过长,因为含水多的低浓度乙醇会将伊红的颜色分化掉。6细胞质过染、分色不足原因:伊红染色液浓度太高,特别是焰红燃料、四溴四氯荧光素钠的存在;切片在伊红染色时间过长;切片在伊红染色后经乙醇脱水步骤时过的太快,而使乙醇分化伊红的作用不能产生。对策:适当稀释伊红染色液,减少伊红染色时间,或者使切片在乙醇脱水等步骤时,停留时间相对均匀。同样,也要检查切片的厚度是否合适。7切片中出现蓝黑色沉淀物原因:苏木精染色液中的金属膜,黏附在玻片上。对策:每天染色前仔细过滤苏木精染色液,或建议使用半氧化苏木精染色液,如Gill苏木精染色液,可以避免过多的金属膜产生。8显微镜下见切片内有大量水珠原因:切片经梯度乙醇处理后没有完全脱水,导致二甲苯透明中性树胶封固后残留大量水分。对策:移去盖玻片,用二甲苯溶解封固剂如中性树胶。将切片置入新鲜的无水乙醇换几道。待切片重新脱水完全后,用新二甲苯透明,中性树胶封固。所有用于脱水和透明的液体,在使用一定时间以后,应即时更换。9光镜下切片某些区域难以聚焦原因:盖玻片上可能有封固切片的封固剂。对策:移去盖玻片,重新用干净的盖玻片封片。检查切片封片方法,是人工手工封法,还是机器自动封法,如有问题及时调整。10封固剂从盖玻片与载玻片之间的缝隙回缩原因:盖玻片弯曲或不平整;封固剂含二甲苯过多,稀释过度。对策:移去盖玻片,重新找一张盖玻片,用干净的封固剂封片。如用手工封片法,每天保证盛装封固剂的容器,在封固结束的时候盖紧盖子。尽量使用小的容器盛装封固剂,一旦封固剂太粘稠,就可以废弃不再使用。11切片从脱蜡的二甲苯经过梯度乙醇进入水溶液时,水和玻片呈现乳白色混浊改变原因;用于脱蜡的二甲苯没有被乙醇洗干净。对策:更换洗涤二甲苯的乙醇液体,把切片重新放回无水乙醇,脱去玻片上的水分。12细胞核灰蓝原因:可能的原因是由于组织处理温度过高、过热,在石蜡停留的时间过长;或者固定时间太短,接下来就直接在高浓度的乙醇中行脱水处理。对策:理论上来说,加热处理仅在组织浸蜡步骤才使用,组织不能在热的蜡液中停留过长时间。如果由于某些原因不能进行下步包埋处理,完成浸蜡处理后的组织,可将组织连同塑料包埋盒一并放置在室温空气中,冷却凝固,以备包埋。待需要包埋时再重新加温直至石蜡融化即可。组织在处理前必须确保固定良好,脱水最好能从低浓度的乙醇开始。13HE染色不规则或不均匀, 从小斑点到大面积区域, 散布切片各处,细胞核染色质不够细致原因:由于使用密闭式组织处理机故障,如密闭不严,导致组织浸蜡时含有水和(或)固定剂。对策:如果使用开放式组织处理模式,在相对湿度较高的地方,用甲苯替代二甲苯。如果使用密闭式组织处理模式,经常仔细检查仪器设备的各项功能是否完好,一旦发现密闭垫圈老化,应及时更换。14细胞核和细胞质着色深,呈强嗜碱性,特别是在组织的边缘原因:因激光或电切技术,导致大体组织标本变性,通常使得细胞核和细胞质被深染呈强嗜碱性着色。对策:目前还没有针对这一人为改变的有效方法。15切片