LAMP技术原理与应用.pdf

1 1 LAMP技术原理及应用LAMP技术原理及应用 陈蕾陈蕾 北京蓝谱生物科技有限公司北京蓝谱生物科技有限公司 E mail chenlei Tel 010 82101210 1 E mail chenlei Tel 010 82101210 1 Mob陈蕾陈蕾 北京蓝谱生物科技有限公司北京蓝谱生物科技有限公司 E mail chenlei Tel 010 82101210 1 E mail chenlei Tel 010 82101210 1 Mob2 2 从样本中抽取 提纯 DNA RNA 检测 基因扩增 检测 基因扩增 基因检测的流程基因检测的流程基因检测的流程基因检测的流程 扩增 检测 二步反应 PCR 扩增 检测 一步反应 LAMP 3 3 LAMPLAMPLAMPLAMP法和法和法和法和PCRPCRPCRPCR法的比较法的比较法的比较法的比较 简单 快速 准确的基因扩增法简单 快速 准确的基因扩增法 LAMPLAMPPCRPCR 温度 反应全程恒温 必须要有热循环温度 反应全程恒温 必须要有热循环 时间 约 分钟 小时时间 约 分钟 小时 产 物 量 约 产 物 量 约 倍 100亿倍 约 倍 100亿倍 约 倍 1千万倍 倍 1千万倍 特 异 性 极高 区域 引物 区域 引物特 异 性 极高 区域 引物 区域 引物 检测 无需其他检测步骤 根据扩增反应发生与 否判断 需其他检测步骤检测 无需其他检测步骤 根据扩增反应发生与 否判断 需其他检测步骤 试剂 无需特殊试剂 无需特殊试剂试剂 无需特殊试剂 无需特殊试剂 4 4 LAMP法的引物设计LAMPLAMP法的引物设计法的引物设计 5 5 LAMP法使用的酶LAMPLAMP法使用的酶法使用的酶 链置换型链置换型链置换型链置换型DNADNA聚合酶聚合酶聚合酶聚合酶 BstBst DNA PolymeraseDNA Polymerase 引物 双链DNA 聚聚聚聚 引物 双链DNA解离的同时 聚聚聚聚 引物 持续链伸长 聚聚聚聚 解离下来的单链DNA 扩增对象为双链DNA时 其中一条链解离的同时进行链伸长 LAMP法使用最适温度65 的聚合酶 6 6 解离链 结合 5 F1c 5 Target DNA 3 3 3 F3cB1F2c F1cB2B35 F1c 5 3 F2B1c B2c B3cF1 5 F1c F2 3 2 1 2 1 F3cB1F2c F1cB2B35 3 F2B1c B2c B3cF1 3 F3cB1F2c F1cB25 3 B3 F3cB1F2c F1cB25 3 3 F2B1c B2c B3cF1F3 B3 FIP F3 Primer F3cB1F2c F1cB2B35 F3F1F2B1c B2c B3c 5 3 4 4 F1cF2B1c B2c B3c 5 3 F1 3 结合 结合 解离连 结合 5 7 5 7 F1cB1cF2F1B2cB3c5 3 F1B1F2c F1cB2B33 5 8 8 F1c F1 F2c B1 5 3 B3 Primer B1c B2 F2 5 F1B1c B2c B3c3 3 5 F1c B1c B2 5 BIP 6 6 F1cB1cF2F1B2cB3c5 3 F1 F2c F1c3 5 B2 B1c 环状构造 环状构造 环状构造 LAMPLAMPLAMPLAMP法的原理法的原理法的原理法的原理 哑铃状模板构造的形成过程哑铃状模板构造的形成过程哑铃状模板构造的形成过程哑铃状模板构造的形成过程 7 7 LAMPLAMPLAMPLAMP法的原理法的原理法的原理法的原理 扩增循环扩增循环扩增循环扩增循环 BIP 8 8 9 10 11 9 10 11 F1 F1 F1c F1c F2 F2c F1 F1 F1c F1c F2 F2c F2c B1 B1c B1 B1 B1 B1c B1c B2c B2 B1 B1c B2c F1 F1c B2c F1 F1 F1c F1c F2F2c B1 B1 B1c B1c B2c B2 F1 F1 F1c F1c F2 F2cB1 B1c B1c B1 B2cB2 B2 FIP F2cF2 F1 F1c F1cFIP B1 B2c B1c F1c F1 F1c F2F2c B1 B1c B2 B2 B1c B2 B1c F2 F1 F1cB1 B1c B2c BIP B2 B1c F2 8 8 9 9 环引物的应用环引物的应用环引物的应用环引物的应用 8 8 Loop Primer B 11 11 Loop Primer F F1 B1 B1c B2 F1c F1c F2cF2 3 5 B1c B2 F1cB1 F1 F2 B1c B2c 3 5 1010 环引物的应用环引物的应用环引物的应用环引物的应用 PSA 癌症转移标志基因 CYP2C19 公牛特异性序列 HBV DNA 快速法 Loop Primer 有 标准法 Loop Primer 无 RNA DNA 1111 Mg2P2O7P2O74 2 Mg2 White precipitate DNA Polymerase PPi P2O7 dNTPs Mg2 DNA DNA dNMP n nPPi LAMP法结果判断方式LAMP法结果判断方式 目视检查混浊 目视检查混浊 1212 Mg2P2O7P2O74 2 Mg2 White precipitate DNA Polymerase PPi P2O7 dNTPs Mg2 DNA DNA dNMP n nPPi LAMP法结果判断方式LAMP法结果判断方式 目视检查混浊 目视检查混浊 1313 LAMP amplification Calcein dNTPs Mn UV quenching Calcein PPi Mn Mn2P2O7 UV fluorescence Mg Mg LAMP法结果判断方式法结果判断方式 目视检查绿色荧光目视检查绿色荧光 1414 误区 染料采用SYBR Green I误区 染料采用SYBR Green I误区 误区 染料采用SYBR Green I染料采用SYBR Green I 反应前加入 抑制LAMP反应 反应后加入 违背了LAMP不开盖原则 SYBR Green I染料灵敏度高 20pg的DNA也能检测 出 不能特异性地指示LAMP产物 反应前加入 抑制LAMP反应 反应后加入 违背了LAMP不开盖原则 SYBR Green I染料灵敏度高 20pg的DNA也能检测 出 不能特异性地指示LAMP产物 1515 Real time turbidimeter LA 320c Time min Turbidity 0 1 0 0 1 0 2 0 3 0 4 0 5 0 6 0 7 0102030405060 Time min 106 105 104 103 102 101 0 copies reaction Turbidity Purified HBV genomic DNA was used as a template 实验室方法建立阶段实验室方法建立阶段 推荐采用标准法LAMP检测 推荐采用标准法LAMP检测 1616 推 荐 理 由推 荐 理 由推 荐 理 由推 荐 理 由 采用闭管扩增 可从源头上控制气溶胶污染 实时检测 可根据各引物反应时间 效率筛选 最佳引物及反应浓度 LAMP反应时间的确定 1717 误区 选择阴性对照不反应的引物误区 选择阴性对照不反应的引物误区 误区 选择阴性对照不反应的引物选择阴性对照不反应的引物 0 1 0 0 1 0 2 0 3 0 4 0 5 0 6 0 7 0 8 020406080100120140 Time Turbidity 10 7 10 6 10 5 10 4 10 3 10 2 10 1 NC 引物选择 引物选择 反应时间短 扩增效率高 阴性对照出峰时间是阳 性最低检出限出峰时间的1 5倍以上 引物选择 引物选择 反应时间短 扩增效率高 阴性对照出峰时间是阳 性最低检出限出峰时间的1 5倍以上 1818 LAMP方法建立阶段所需的试剂LAMP方法建立阶段所需的试剂LAMP方法建立阶段所需的试剂LAMP方法建立阶段所需的试剂 模板模板 DNA 引物引物 FIP F3 BIP B3 Bst DNA 聚合酶聚合酶 dNTPs 反应缓冲液反应缓冲液 DNA 扩增扩增DNA 扩增扩增 模板模板RNA 引物引物 FIP F3 BIP B3 Bst DNA聚合酶聚合酶 逆转录酶逆转录酶 dNTPs 反应缓冲液反应缓冲液 RNA 扩增扩增RNA 扩增扩增 1919 LAMP法实验室常规操作步骤LAMP法实验室常规操作步骤LAMP法实验室常规操作步骤LAMP法实验室常规操作步骤 DNA RNA 抽取 提纯抽取 提纯 扩增扩增 检测检测 样本样本 1 试剂调配试剂调配 2 样本样本DNA RNA添加添加 3 LAMP反应 扩增 反应 扩增 4 检测检测 目视检测 荧光 目视检测 荧光 实时浊度检测实时浊度检测 样本中样本中 RNA DNA的抽取的抽取 约半小时 约 约半小时 约1 5小时 以内 小时 以内 2020 临床诊断试剂操作步骤临床诊断试剂操作步骤临床诊断试剂操作步骤临床诊断试剂操作步骤 干燥剂型产品 实现了试剂调配过程的简单化 并且使试剂的常 温保存成为可能 区别于传统冷冻保存 干燥剂型产品 实现了试剂调配过程的简单化 并且使试剂的常 温保存成为可能 区别于传统冷冻保存 核酸提取简单化 例如流感检测试剂盒仅需把棉签在试剂中搅拌即 可完成抽取步骤 核酸提取简单化 例如流感检测试剂盒仅需把棉签在试剂中搅拌即 可完成抽取步骤 核酸提取简单化 例如流感检测试剂盒仅需把棉签在试剂中搅拌即 可完成抽取步骤 核酸提取简单化 例如流感检测试剂盒仅需把棉签在试剂中搅拌即 可完成抽取步骤 样品前处理的考虑 样品前处理的考虑 样品前处理的考虑 样品前处理的考虑 反应液的考虑 反应液的考虑 反应液的考虑 反应液的考虑 不仅仅通过实时浊度 荧光 目视法也能进行结果判断 不仅仅通过实时浊度 荧光 目视法也能进行结果判断 不仅仅通过实时浊度 荧光 目视法也能进行结果判断不仅仅通过实时浊度 荧光 目视法也能进行结果判断 结果判定的考虑 结果判定的考虑 结果判定的考虑 结果判定的考虑 2121 简易操作过程 以甲型流感为例 简易操作过程 以甲型流感为例 提取咽拭子 放在抽取液中 加入样本 用干粉试管 加入反应引物 颠倒混合5次 干粉状试剂 可常温保存 新型A型 结果判断 目测或浊度仪 RT LAMP 反应 35分钟 提取样本检测完成1小时之内小时之内 LAMP 快速 简便 高特异 低成本 2222 流感试剂操作简介流感试剂流感试剂操作简介操作简介 扩增试剂 反应试管 取出需要的 管数 样本 扩增试剂 反应试管 取出需要的 管数 样本 2 备用 备用 试剂准备试剂准备试剂准备试剂准备 引物溶液引物溶液 新型流感用新型流感用 H1P or 甲型流感用甲型流感用 FluA 试剂分注试剂分注试剂分注试剂分注 10 L 15 L 核酸抽取核酸抽取核酸抽取核酸抽取 加样加样加样加样 LAMPLAMP反应反应反应反应 离心后放入仪器离心后放入仪器 62 5 35分钟反应62 5 35分钟反应 判定结果判定结果判定结果判定结果 观察荧光观察荧光 通过浊度上升判断通过浊度上升判断 添加样品 对照添加样品 对照 将引物溶液分注到反应试管中将引物溶液分注到反应试管中 倒置后静置2分钟 颠倒混合5次倒置后静置2分钟 颠倒混合5次 添加引物添加引物添加引物添加引物 用采样棉签在抽取试剂重搅拌 后 作为样品 用采样棉签在抽取试剂重搅拌 后 作为样品 2323 小结 小结 小结 小结 扩增反应在等温条件 扩增反应在等温条件 60 65 下连续进行 下连续进行 可以使用简便 廉价的扩增装置 可以使用简便 廉价的扩增装置 扩增效率高 可在短时间内完成扩增扩增效率高 可在短时间内完成扩增 可在短时间内得出结果 可在短时间内得出结果 有非常高的特异性有非常高的特异性 可得出 可得出 扩增反应发生扩增反应发生 有目的菌存在有目的菌存在 的结论的结论 产生大量扩增产物 检测方法简便 产生大量扩增产物 检测方法简便 无需用电泳 特殊探针等 可通过浊度仪 荧光目 视方法确认扩增结果 无需用电泳 特殊探针等 可通过浊度仪 荧光目 视方法确认扩增结果 从扩增到检测可在从扩增到检测可在1个反应试管内 封闭系统 完成个反应试管内 封闭系统 完成 可防止由于扩增产物产生的污染 可防止由于扩增产物产生的污染 从从RNA经一步反应可完成扩增经一步反应可完成扩增 无需另外进行逆转录反应 无需另外进行逆转录反应 2424 LAMPLAMPLAMPLAMP法的应用法的应用法的应用法的应用 2525 临床领域临床领域 病原菌 病毒的检测 及鉴定 通过SNP多态性分型 决定用药量 病原菌 病毒的检测 及鉴定 通过SNP多态性分型 决定用药量 农业领域农业领域 植物病害的早期发 现及蔓延防止 转基因作物的检测 植物病害的早期发 现及蔓延防止 转基因作物的检测 畜牧业领域畜牧业领域 雌雄性别判断 雌雄性别判断 病原微生物的检测 遗传病的发现 病原微生物的检测 遗传病的发现 食品领域食品领域 食物中毒致病菌的检测 食品的卫生管理 食物中毒的防止 食物中毒致病菌的检测 食品的卫生管理 食物中毒的防止 环境领域环境领域 环境 水中病原微生物 的检测 环境 水中病原微生物 的检测 灵活运用能够简单 快速地进行基因扩增的特征 在各个领域得到广 泛应用 灵活运用能够简单 快速地进行基因扩增的特征 在各个领域得到广 泛应用 工业领域工业领域 工业产品用大量 DNA的生产成为可能 工业产品用大量 DNA的生产成为可能 例如例如例如例如 LAMP法的应用领域LAMPLAMP法的应用领域法的应用领域 2626 LAMP法的应用例 科研 法的应用例 科研 LAMP法的应用例 科研 法的应用例 科研 论文报告 科研 临床对象 论文报告 科研 临床对象 细菌 真菌 寄生虫 结核菌 耐酸菌 肺炎链球菌 支原体 流感嗜血杆菌 百日咳菌 绿脓杆菌 MDR MRSA 疟疾 肠毒毒素大肠杆菌 组织侵袭性大肠杆菌 EIEC 伪膜性结肠炎 Enterococcus faecalis 口腔细菌 齿周炎病菌 绿脓杆菌 H pylori 真菌 病毒 HSV CMV VZV EBV HHV 6 HHV 7 HHV 8 腮腺炎病毒 麻疹病毒 RSV 日本脑炎病毒 细小病毒B19 风疹病毒 登革热病毒 埃博拉病毒 腺病毒 流感病毒 HPV HAV 感染症以外应用 胃癌微转移术中快速诊断 PubMed检索 keyword LAMP isothermal amplification 进行引物设计 确立进行引物设计 确立进行引物设计 确立进行引物设计 确立LAMPLAMPLAMPLAMP法检测体系法检测体系法检测体系法检测体系 学会报告 论文发表学会报告 论文发表学会报告 论文发表学会报告 论文发表 II LAMP法 2727 LAMP法试剂盒产品LAMPLAMP法试剂盒产品法试剂盒产品 细菌 原生动物 环境卫生检查用 Loopamp 军团菌军团菌检测试剂盒E 公定法収載 公定法収載 Loopamp 检测试剂盒 Loopamp 检测试剂盒 食品 环境检测用 Loopamp 沙门氏菌沙门氏菌检测试剂盒 Loopamp 肠道出血性大肠杆菌肠道出血性大肠杆菌检测试剂盒 公定法収載 公定法収載 Loopamp 毒素 VT 毒素 VT 试剂盒 Loopamp 大肠杆菌O157大肠杆菌O157检测试剂盒 LoopampL monocytogenesL monocytogenes检测试剂盒 Loopamp 检测试剂盒 Loopamp 引物组A acidoterrestris Loopamp 引物组 冷水病菌冷水病菌 指針収載 指針収載 病毒 Loopamp H5亜型 H5亜型 检测试剂盒 体外診断用医薬品 体外診断用医薬品 Loopamp SARS冠状病毒SARS冠状病毒检测试剂盒 体外診断用医薬品 体外診断用医薬品 Loopamp 诺如病毒GI诺如病毒GI 检测试剂盒 Loopamp 诺路病毒GII诺路病毒GII 检测试剂盒 Loopamp 引物组WNVWNV Loopamp 引物组Avian Flu H5Avian Flu H5 Loopamp 引物组Avian Flu H7Avian Flu H7 Loopamp 引物组KHVKHV 指針収載 指針収載 H1 pdm 2009H1 pdm 2009引物组 干燥剂形用 FluAFluA引物组 干燥剂形用 SNP 单碱基多型 Loopamp P450 P450 试剂盒 CYP2C19 2 Loopamp P450 P450 试剂盒 CYP2C19 3 Loopamp P450 P450 试剂盒 CYP2C9 3 其他 Loopamp 牛胚胎性别判断牛胚胎性别判断试剂盒 Loopamp 诺如病毒G 检测试剂盒 Loopamp 诺如病毒G 检测试剂盒 Loopamp H5亚型禽流感检测试剂盒Loopamp H5亚型禽流感检测试剂盒 2828 应用LAMP法的诊断试剂应用应用LAMPLAMP法的诊断试剂法的诊断试剂 LoopampLoopamp SARS冠状病毒检测试剂盒SARS冠状病毒检测试剂盒 2003年12月 作为体外诊断用医药品开始销售 2010年6月2日 生产销售许可取得 2003年12月 作为体外诊断用医药品开始销售 2010年6月2日 生产销售许可取得 LoopampLoopamp