综合性实验植物体内过氧化物酶活性测定及同工酶电泳.ppt

综合性实验植物体内过氧化物酶活性测定及同工酶电泳 过氧化物酶活性测定一 原理1 过氧化物酶 peroxidase POD 广泛存在于各种动物 植物和微生物体内 催化由过氧化氢参与的各种还原剂的氧化反应 RH2 H2O2 2H2O R2 POD分子结构特点 POD是一种由单一肽链与卟啉构成的血红素蛋白 脱辅基蛋白分子须与血红素结合才构成全酶 3 POD的主要生理功能 参与活性氧代谢过程 参与木质素和木栓质的合成 参与生长素的降解 二 实验材料与试剂1 材料 玉米幼苗2 试剂 0 1mol L磷酸缓冲液 pH6 0 0 1mol L磷酸缓冲液 pH7 0 愈创木酚 H2O2三 实验步骤1 提取酶液 取样品1 0g 加入2ml的0 05mol LpH5 5的磷酸缓冲液 冰浴研磨 10000rpm 4 离心后取上清 即为粗酶液 2 酶活性测定 采用愈创木酚比色法测定 对照为煮沸5分钟的粗酶液 反应体系包括 0 05mol LpH5 5的磷酸缓冲液2 9ml 0 05mol L愈创木酚1ml 2 H2021ml 粗酶液0 1ml 反应1分钟后 立刻在470nm下 测定OD值 以每分钟在470nm处吸光度的变化0 01为一个酶活单位 3 计算酶活性 选取OD值变化较均匀的一段数据 代入公式计算 以每分钟OD值变化0 01作为1个过氧化物酶活力单位 U 酶活力 活力单位 U w gFW 注 W W总 gFW V ml V总 POD活性 U g min 注 A470为反时间内吸光度的变化 w为样品质量t为反应时间Vt为提取酶液总体积Vs为测定时间酶液体积 A470 Vt W Vs 0 01 t 同工酶电泳一 原理聚丙烯酰胺凝胶由丙烯酰胺和交联剂甲叉双丙烯酰胺在催化剂作用下聚合而成 具有三维网状结构 其网孔大小可由凝胶浓度和交联度加以调节 凝胶电泳兼有电荷效应和分子筛效应 被分离物质由于所载电荷数量 分子大小和形状的差异 因此在电泳时产生不同的泳动速率而相互分离 利用特异性的颜色反应使待测酶着色 这样就可在凝胶中展现出酶谱 过氧化物酶是植物体内常见的氧化酶 植物体内许多生理代谢过程常与它的活性及其同工酶的种类有关 利用过氧化物酶能催化H2O2把联苯胺氧化成蓝色或棕褐色产物的原理 将经过电泳后的凝胶置于有H2O2及联苯胺的溶液染色 出现蓝色或棕褐色部位即为过氧化物酶同工酶在凝胶中存在的位置 多条有色带即构成过氧化物酶同工酶谱 本实验利用垂直板凝胶电泳 采用Tris Gly缓冲系统来分离阴离子过氧化物酶同工酶 二 材料 仪器设备及试剂1 材料 玉米幼苗2 仪器设备 稳流稳压电泳仪 冷冻离心机及离心管 pH试纸 3 试剂 1 分离胶缓冲液 pH8 9 1mol LHCl48ml Tris36 6g TEMED0 23ml 加水定容至100ml 2 分离胶贮液 30g丙烯酰胺 0 8g甲叉双丙烯酰胺 加水溶解并定容至100ml 过滤后使用 3 过硫酸铵溶液 过硫酸铵0 2g 加水定容至100ml制胶时现配现用 4 浓缩胶缓冲液 1mol LHCl48ml Tris5 98g TEMED0 46ml 调pH6 7 并定容至100ml 5 浓缩胶贮备液 丙烯酰胺10g 甲叉双丙烯酰胺2 5g 加水定容到100ml 使用前过滤 6 电极缓冲液 Tris6 0g Gly28 8g 用水定容至1000ml pH8 3 用前稀释10倍 7 四甲基乙二胺 TEMED 8 0 1 的溴酚蓝水溶液 9 联苯胺染色母液 联苯胺1g 冰醋酸18ml H2O2ml溶解贮于棕色瓶中 三 实验步骤1 安装电泳槽2 凝胶的配制3 过氧化物酶的提取 称取1g待测植物鲜样置于冰浴上的研钵内 加入1mlH2O或0 05mol LTris HCl缓冲液 pH6 8 研成匀浆 转入离心管 再用2ml前述溶液将附着在研钵壁上的研磨样品洗下并全部转入离心管 3500rpm离心15 20min 上清液即为酶提取液 供电泳分析用 4 点样 取10ul样品加等体积的40 的蔗糖溶液和5ul2 的溴酚蓝5 电泳6 剥胶 电泳完毕 将电泳槽取出 倒去缓冲液 取下凝胶管 放入培养皿中 用一个带有长针头的注射器 吸满水 将针头沿管壁插入 同时慢慢地将注射器中的水推出 并不断转动凝胶管 将凝胶管挤脱出来 也可用洗耳球挤压 7 染