微生物学实验报告.doc

实验一、培养基的制备与灭菌实验一、目的与要求1、了解各种培养基的配制及分装方法2、掌握高压蒸汽灭菌二、基本原理牛肉膏蛋白胨培养基：是一种应用最广泛和最普通的细菌基础培养基，有时又称为普通培养基。由于这种培养基中含有一般细胞生长繁殖所需要的最基本的营养物质，所以可供细菌生长繁殖之用。高压蒸汽灭菌：主要是通过升温使蛋白质变性从而达到杀死微生物的效果。将灭菌的物品放在一个密闭和加压的灭菌锅内，通过加热，使灭菌锅内水沸腾而产生蒸汽。待蒸汽将锅内冷空气从排气阀中趋尽，关闭排气阀继续加热。此时蒸汽不溢出，压力增大，沸点升高，获得高于100的温度导致菌体蛋白凝固变性，而达到灭菌的目的。三、试剂、仪器及用具试剂：蛋白胨、牛肉膏、琼脂、葡萄糖、蔗糖、可溶性淀粉、麦芽汁、马铃薯、黄豆芽、NaCl、NaNO3、K2HPO4、KCl、MgSO4.7H2O、FeSO4.7H2O、无水乙醇、无菌水、HCl、NaOH仪器：高压蒸汽灭菌锅、天平、电炉、烧杯、试管、量筒、玻璃棒、锥形瓶、漏斗、吸管、纱布、棉花、PH试纸、滤纸、标签纸、记号笔、防水油纸或报纸四、实验方法与步骤原料称量溶解（加琼脂熔化）调节PH值分装塞棉塞仓扎灭菌摆放斜面或倒平板主要配制的培养基营养琼脂培养基：成分：蛋白胨10g，牛肉膏3g，NaCl5g，琼脂20g，蒸馏水1000ml，pH7.2.制法：将除琼脂以外的各成分溶解于蒸馏水中，校正pH，加入琼脂，分装于烧杯瓶内，121C、15min高压灭菌备用。注：其他成分不变，当琼脂加量为3.54g是为半固体营养琼脂。豆芽汁葡萄糖培养基：成分：黄豆芽10g，葡萄糖5g，琼脂1.52g，水100ml，自然pH。制法：称新鲜黄豆芽10g，置于烧杯中，再加入100ml水，小火煮沸30min，用纱布过滤，补足失水，即制成10%的豆芽汁。配置时，按每100ml10%豆芽汁加入5g葡萄糖，煮沸后加入2g琼脂，继续加热熔化，补足失水。分装后121C灭菌20min。查氏培养基成分：NaNO32g，K2HPO41g，MgSO4.7H2O0.5g，KCl0.5g，FeSO4.7H2O0.01g，蔗糖30g，琼脂1520g，蒸馏水1000ml，pH自然。制法：加热溶解，分装后121C灭菌20min。马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）：成分：马铃薯（去皮）200g，葡萄糖（或蔗糖）20g，琼脂20g，水1000ml。制法：pH自然。将马铃薯去皮、洗净、切成小块，称取200g加入1000ml蒸馏水，煮沸20min，用纱布过滤，滤液补足水至1000ml，再加入糖和琼脂，溶化后分装，121C灭菌20min。另外，用少量乙醇溶解0.1g氯霉素，加入1000ml培养基中，分装灭菌后可用于食品中霉菌和酵母菌计数、分离。五、高压蒸汽灭菌法1、基本原理2、高压蒸汽灭菌主要构成部分3、主要操作过程（1）加水（2）装料（3）加盖（4）加热排气（5）升压（6）保压（7）降压六、注意事项1、培养基分装时不要使培养基沾管口或瓶口2、培养基制备完毕后应立即进行灭菌3、不同成分的培养基要采用不同的杀菌条件七、思考题1、培养基配好以后，为什么必须立即进行灭菌？如何检查灭菌后的培养基是无菌的？培养基配制好后,是要是用于细胞的培养,由于空气及各种配料中的各种各样细胞非常多,如果不先灭菌,在培养是由于本底中的细菌带来了干扰,使用实验失败.要检查培养基的灭效果方法非常简单,将培养基放在将要做实验的温箱中进行培养(时间与培养实验一致,一般是24小时)看灭菌后培养基的菌落就可以判断.有时也为了使用培养更加科学,在做细菌培养时,除在在涂上需要培养的菌种外,同时另外加一个培养基(空白)同时进行同条件培养进行对比.2、高压蒸汽灭菌的关键为什么是高温而不是高压？描述其方法及原理。因为是靠湿热高温使微生物蛋白质变性，从而达到灭菌的目的。实验二、普通光学显微镜的使用一、 目的要求（1） 学习显微镜的结构、各部分功能和正确的使用方法。（2） 学习并掌握油镜的原理及使用方法。二、 基本原理：普通光学显微镜是利用目镜和物镜两组透镜系统来放大成像的。由机械装置和光学系统两部分构成。1、 增加照明亮度。油镜的放大倍数可达100X，在使用油镜时必须在油镜和载玻片之间加入与玻璃的折射率（n=1.55）相仿的香柏油（n=1.52）。2、 提高显微镜的分辨率。显微镜的分辨率是指显微镜能辨别两点之间的最小距离的能力。物理学角度看，光学显微镜的分辨率受光的干涉现象及所用物镜性能的限制，可表示为： 分辨率=入ZNA 式中入光波波长NA物镜的数值孔径值三、 实验材料1、 菌种。金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌。2、 试剂及其他用具试剂：香柏油、二甲苯仪器：酒精灯、载玻片、接种环、双层瓶、擦镜纸、镊子四、 实验方法与步骤1、 观察前准备（1） 显微镜安置 （2）光源调节2、 显微观察（1）低倍镜观察。将染色标本玻片置于载物台上，用标本夹夹住，使观察对象处于物镜的正下方。使其接近标本，用粗调节器慢慢升高镜筒，使标本在视野中初步聚焦，再用细调节器调节，使图像清晰。（2）高倍镜观察。轻轻转动物镜转换器。将高倍镜移工作位置，对视野亮度进行适当调整后，微调细调节器，使物象清晰。（3）油镜观察。用粗调节器将镜筒升高，将油镜转到工作位置，滴香柏油，从侧面注视。用粗调节器将镜筒小心降下，使油镜浸在香柏油中并与标本相连，开足光圈，使视野亮度合适。用粗调节器将镜筒上升，直至视野中出现物镜。用细调节器使其清晰聚焦。3、显微镜用毕后处理（1）上升镜筒，取下载物片（2）用擦镜拭去镜头上的香柏油，然后蘸少许二甲苯拭去残留的油迹，用干净的擦镜纸擦去残留的二苯基。五、实验报告。绘制出你在显微镜下观察到的各菌的形态图。 六、 思考题1、 使用光学显微镜应注意哪些事项？（1）持镜时必须是右手握臂、左手托座的姿势，不可单手提取，以免零件脱落或碰撞到其它地方。（2）轻拿轻放，不可把显微镜放置在实验台的边缘，以免碰翻落地。（3）保持显微镜的清洁，光学和照明部分只能用擦镜纸擦拭，切忌口吹手抹或用布擦，机械部分用布擦拭。（4）水滴、酒精或其它药品切勿接触镜头和镜台，如果沾污应立即擦净。（5）放置玻片标本时要对准通光孔中央，且不能反放玻片，防止压坏玻片或碰坏物镜。（6）要养成两眼同时睁开的习惯，以左眼观察视野，右眼用以绘图。（7）不要随意取下目镜，以防止尘土落入物镜，也不要任意拆卸各种零件，以防损坏。（8）使用完毕后，必须复原才能放回镜箱内，其步骤是：取下标本片，转动旋转器使镜头离开通光孔，下降镜台，平放反光镜，下降集光器(但不要接触反光镜)、关闭光圈，推片器回位，盖上绸布和外罩，放回实验台柜内。最后填写使用登记表。(注：反光镜通常应垂直放，但有时因集光器没提至应有高度，镜台下降时会碰坏光圈，所以这里改为平放)2、 使用油镜时，载玻片镜头间滴什么油，起到什么作用？加香柏油,作用是增加折光率,也就是增加了显微镜的分辨率。实验三、细菌的简单染色和革兰氏染色1、 目的要求（1） 学习微生物涂片、染色的基本技术（2） 掌握细菌简单染色、革兰氏染色、初步认识细菌的形态、特征2、 基本原理（1）简单染色法：用单一染料进行细菌染色，操作简便，适于菌体一般形状和细菌排列的观察。 常用碱性染料进行简单染色，这是因为：在中性、碱性或弱碱性溶液中，细菌细胞通常带负电荷，而碱性染料在电离时，其分子的染色部分带正电荷（酸性染料电离时，其分子的染色部分带正电荷），因此碱性染料的染色部分很容易与细菌结合使细菌着色，经染色后的细菌细胞与背景形成鲜明的对比，在显微镜下易于识别。常用作简单染色的染料有：美蓝、结晶紫、碱性复红等。（2）革兰氏染色法革兰氏染色反应是细菌分类和鉴定的重要性状。它是1884年由丹麦医生Gram创立的。革兰氏染色法（Gram stain）不仅能观察到细菌的形态特征而且还可将所有细菌区分为两大类：染色反应呈蓝紫色的称为革兰氏阳性细菌，用G+表示；染色反应呈红色（复染颜色）的称为革兰氏染色阴性细菌，用G-表示。细菌对于革兰氏染色的不同反应，是由于它们细胞壁的成分和结构不同造成的。革兰氏阳性细菌的细胞壁主要是肽聚糖形成的网状结构组成的，在染色过程中，当用乙醇处理时，由于脱水而引起网状结构中的孔径变小，通透性降低，使结晶紫碘复合物被保留在细胞内而不易着色，因此，呈现蓝紫色；革兰氏阴性细菌的细胞壁中肽聚糖含量低，而脂类物质含量高，当用乙醇处理时，脂类物质溶解，细胞壁的通透性增加，使结晶紫碘复合物易被乙醇抽出而脱色，然后又被染上了复染液（番红）的颜色，因此呈现红色。革兰氏染色需用四种不同的溶液：碱性染料（basic dye）初染液；媒染剂（mordant）；脱色剂（decolorising agent）和复染液(counterstain)。碱性染料的作用象在细菌的简单染色法基本原理中所述的那样，而用于革兰氏染色的初染液一般是结晶紫(crystal violet)。媒染剂的作用是增加染料和细胞之间的亲和力或附着力，即以某种方式帮助染料固定在细胞上，使不易脱落，不同类型的细胞脱色反应不同，有的能被脱色，有的则不能，脱色剂常用95的酒精(ethanol)。复染液也是一种碱性染料，其颜色不同于初染液，复染的目的是使被脱色的细胞染上不同于初染液的颜色，而未被脱色的细胞仍然保持初染的颜色，从而将细胞区分成G+和G-两大类群，常用的复染液是番红。3、 实验材料、试剂、仪器、菌种枯草芽孢杆菌、大肠杆菌4、 实验流程涂片干燥固定草酸铵结晶紫初染水洗碘液媒染水洗95%乙醇水洗沙黄复染水洗滤纸吸干镜检5、 注意事项（1）涂片所用载玻片要