2－遗传性出血病的临床检测和基因诊断(王鸿利）.ppt

遗传性出血病临床检测和基因诊断 上海交通大学医学院附属瑞金医院王鸿利2007 4 研究对象 表1遗传性出血病的研究 技术平台 建立技术平台临床表现 家系调查表型检测基因诊断突变基因的功能研究携带者和产前诊断 家系资料 实验表型 基因诊断 临床资料 体外表达研究 临床诊断 临床治疗 诊断和治疗流程 临床表现以广泛出血为临床特征 血友病的出血特征大关节肌肉皮肤粘膜内脏创伤手术 临床表现以广泛出血为临床特征 其他出血病的出血特征 皮肤瘀斑粘膜 鼻 口腔 出血月经过多 持续时间长内脏出血创伤出血 手术出血难止 家系调查 性连锁隐性遗传 例如血友病A B等 家系调查 常染色体隐性遗传 AR 例如FII V VII X XI XII XIII缺乏症等 家系调查 常染色体显性遗传 AD 例如 毛细血管扩张症 异常纤维蛋白原血症 部分VWD 表型诊断 一期止血缺陷筛选试验 表型检测 一期止血缺陷诊断试验 表型诊断 二期止血筛选试验 表型诊断 二期止血诊断试验 表型检测 VWD的检测 VWD实验诊断和分型流程 在人类基因库中寻找相关的基因序列 PCR扩增 PCR产物的纯化 RFLP 基因诊断 直接测序 TA克隆 RT PCR AS PCR RealtimePCR 技术平台 遗传性出血病的基因诊断 例如血友病A 内含子22倒位 占47 48 血友病A 内含子1倒位 血友病A 其他突变的检测 血友病A 非内含子22 内含子1倒位间接连锁分析 9个多态性位点直接基因测序 例如 遗传性凝血因子VII缺陷症 F7基因图 Arg304Trp normal 10966 8delC 5例遗传性凝血因子VII缺陷症实验表型及基因检测结果 国际首次报道的基因突变 vWF基因大片段缺失致病的分子基础 1 8kb 缺失 63 1 8 约61kb vWF基因大片段缺失致病的分子基础 1 8kb 缺失 63 1 8 约61kb vWF大片断缺失致病的分子基础 发夹结构 Bloodcell molecules andDiseases inpress 2006 国际上首次综合运用多种insilico 复杂性 重组相关元件和核基质结合区 分析1个3型vWD患者的vWF基因大片段缺失分子基础 转染真核细胞 生物代谢标记 活性与抗原检测 免疫荧光染色 Western印迹 定量PCR 构建突变基因cDNA的表达载体 突变基因功能研究 国际首报14种突变基因致病的分子基础 血友病携带者和产前诊断 传统方法采集羊水 血友病携带者和产前诊断 PCR扩增 外周血DNA抽提 携带者 直接核酸测析 间接联锁分析 明确诊断 长链PCR检测内含子1 22倒位 血友病A 羊水DNA抽提 胎儿 血友病A间接连锁分析 国外多采用2个STR CA13 CA22 及2个SNPs BcII Hind 诊断率约为80 Hemophilia Chapman39 12 1204 1208 血友病A间接连锁分析 F8C F8Civs13 G6PD DXS9901 DXS15 DXS1108 DXS1073 DXS52 F8Civs22 BclI 性别基因位点 联合9个多态性位点及性别基因位点 累积识别能力99 6 建立7重荧光PCR技术诊断率和准确率均为100 欧美国家利用F9基因内的6个多态性位点 可对89 的血友病B作出诊断 BrJHaemato11993 84 101 105 亚洲人这些位点的诊断信息几乎为0 HumHered 1992 42 3 204 5 血友病B间接连锁分析 寻找杂合度较高的F9基因外的6个STR位点 累积识别能力为99 99 本项目的诊断率和准确率均为100 血友病B间接连锁分析 DXS1192DXS1211DXS102DXS8013F9DXS1227DXS8094 血友病A B携带者和产前诊断结果 血友病A B携带者和产前诊断结果 目前 以4 6个家系 月 接收来自全国及海外的