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成都医学院学士学位论文 本本 科科 毕毕 业业 论论 文文 题题 目 目 聚蛋白多糖基因多态性与骨性关节炎相关性研究聚蛋白多糖基因多态性与骨性关节炎相关性研究 姓姓 名 名 学学 号 号 06254000590625400059 院院 系 系 检验医学院检验医学院 年年 级 级 20062006 级级 专专 业 业 医学检验医学检验 指导教师 指导教师 孙鹥主治医师孙鹥主治医师 实习单位 实习单位 云南省第一人民医院云南省第一人民医院 二二 一二一二 年年 五五 月月 成都医学院学士学位论文 目 录 中文摘要 I 英文摘要 II 前 言 1 1 材料与方法 1 1 1 研究对象 1 1 2 排除对象 1 1 3 主要试剂和仪器 1 1 4 方法 1 1 4 1 DNA 提取 1 1 4 2 PCR 扩增 2 1 4 3 电泳 2 1 5 统计学处理 2 2 结果 2 2 1 可变长度重复序列数目确定 2 2 2 PCR 产物电泳 2 2 3 聚蛋白多糖基因多态性分布 3 3 讨论 4 结 论 5 参考文献 5 致 谢 6 诚信声明 6 成都医学院学士学位论文 I 聚蛋白多糖基因多态性与骨性关节炎相关性研究 摘 要 目的 目的 探索骨性关节炎与聚蛋白多糖基因多态性的相关性 方法 方法 单关节骨性关节炎患者 80 例 同时设健康对照组 30 例 应用 PCR 技术扩增两组基因组 DNA 中的聚蛋白多糖基因 以琼脂糖 凝胶电泳测 PCR 产物的基因条带 观察其多态性 结果结果 正常人的重复序列数目以 28 29 为主 骨 性关节炎组以 26 27 28 频率为主 其它重复序列数目无比较意义 结论结论 聚蛋白多糖基因中的重 复序列数目 26 27 28 的频率比较中骨性关节炎组高于正常组 由于标本量的限制 相关性仍需 进一步研究 关键词 骨性关节炎 聚蛋白多糖基因 多态性 成都医学院学士学位论文 II Correlation Study between Aggrecan Gene Polymorphism and Osteoarthritis Abstract Objective To explore the association between osteoarthritis and aggrecan gene polymorphism Methods The study group consisted of 80 patients with single knee osteoarthritis and 30 healthy controls Genomic DNA can be obtained from blood of all people and then aggrecan gene can be amplified by PCR The PCR products can be analyzed by agarose gel electrophoresis Results The significant repeat number in osteoarthritis are 26 27 and 28 while healthy control are 28 and 29 Conclulsion Compared with healthy control the frequency of repeat number 26 27 and 28 are high However based on the currently available data there are unclear correlation between aggrecan gene polymorphism and osteoarthritis So further study should be needed Key words osteoarthritis aggrecan gene polymorphism 成都医学院学士学位论文 1 前 言 骨性关节炎 osteoarthritis OA 是最常见的关节疾病之一 困扰着全世界约2亿多患者 OA的主要病理特点是软骨细胞外基质的降解超过合成 软骨降解的原因很多 但引起该过程的最主 要原因是蛋白水解酶活性的增高 其中聚蛋白多糖酶和基质金属蛋白酶 MMP 是与软骨退行性变关 系最密切的两个家族 MMP曾被认为是降解软骨聚蛋白多糖和胶原的主要酶类 但有研究显示聚蛋白 多糖酶在这一变化中发挥主要作用 而且在骨性关节炎早期可能是唯一降解聚蛋白多糖的酶类 聚 蛋白多糖酶是一种蛋白水解酶 是解整链蛋白金属蛋白酶 ADAMTS 家族的成员 它可以调节软骨细 胞外基质 使其发挥维持关节软骨正常生物化学和内环境稳定的作用 ADAMTS 家族的许多成员在 体外的聚蛋白多糖降解活动中占有一定的数量 包括ADAMTS 1 4 5 8 9 和15 1 4 其中 ADAMTS 1 和ADAMTS 8 也具有聚蛋白多糖酶活性 在软骨中也可见到它们的表达 但是由于 ADAMTS 1 和ADAMTS 8 的作用比较弱 因此被公认的聚蛋白多糖酶只有两个 ADAMTS 4 和ADAMTS 5 个体代谢的差异取决于代谢酶的重要基因位点 DNA 序列不同 这些基因多态性可以影响酶的表 达水平 结构 催化能力等方面 骨关节炎中最早出现的改变是关节软骨的损伤 其病理表现是软 骨细胞外基质含量减少和软骨细胞死亡 其中 聚蛋白多糖丢失是关节炎的主要病理表现之一 在 聚蛋白多糖的降解中聚蛋白多糖酶在这一病理变化中发挥主要作用 聚蛋白多糖酶活性和疾病关系 的研究已开展较多 本实验从聚蛋白多糖酶裂解位点片段的的基因也就是聚蛋白多糖基因的多态性 入手 研究聚蛋白多糖基因与骨性关节炎疾病的相关性 对患者和正常人的聚蛋白多糖基因多态性 进行测定比较 结果报告如下 1 材料与方法 1 1 研究对象 选自 2010 年 1 月到 2011 年 2 月云南省第一人民医院骨科 因膝关节关节炎出现关节肿胀行 MRI 检查的患者 80 例 其中男性 37 例 女性 43 例 25 到 57 岁 平均 37 6 岁 诊断符合中华医 学会骨科学分会 2007 年颁布的骨关节炎诊断指南中 OA 的诊断标准 同时设 30 例健康对照组 1 2 排除对象 有炎症 创伤及手术史 肿瘤 糖尿病等疾病的患者 诊断或者疑似为风湿 类风湿性关 节炎等自身免疫性疾病的患者 检查前两周内使用过糖皮质类固醇激素 非甾体消炎止痛药的患 者 妊娠 哺乳期间的妇女 有感染性关节炎 其他反应性关节炎等关节疾病的患者 重度 OA 需行关节置换的患者 年龄超过57 岁 1 3 主要试剂和仪器 提取DNA的试剂为购自百泰克生物的全血基因组DNA快速提取试剂盒 批号 20050321 PCR试 剂 琼脂糖凝胶电泳的Marker购自宝生物工程 大连 有限公司 DNA扩增设备为SLAN荧光定量PCR 仪 PCR引物委托上海生工合成 1 4 方法 1 4 1 DNA 提取 空腹抽取静脉血2ml于EDTA抗凝管中 颠倒混匀 用百泰克生物全血基因组DNA快速提取试剂盒 提取外周血DNA 具体方法为 取200 l血液放入1 5ml离心管 加入200 l结合液CB 轻摇混 匀 再加入20 l蛋白酶K溶液 轻摇混匀后70 放置10分钟 加入100 l异丙醇轻摇混匀 此时 可能会出现絮状沉淀 将上一步所得溶液加入一个吸附柱AC中 加入500 l去除液 IR 12000rpm离心30秒 弃掉废液 加入700 l漂洗液WB 12000rpm离心30秒 弃掉废液 加 成都医学院学士学位论文 2 入500 l漂洗液WB 12000rpm离心30秒 弃掉废液 将吸附柱AC放回空收集管中 13000rpm2分 钟 尽量除去漂洗液 取出吸附柱AC 放入一个干净的离心管中 在吸附膜的中间部位加100 l 洗脱缓冲液EB 室温放置3 5分钟 12000rpm离心1分钟 将得到的溶液重新加入离心吸附柱中 室 温放置2分钟 12000rpm离心1分钟 20 保存待测 1 4 2 PCR 扩增 参照文献 5 设计的引物序列为上游引物5 TAGAGGGCTCTGCCTCTGGAGTTG 3 下游引物5 AGGTCCCCTACCGCAGAGGTAGAA 3 PCR反应体系为25 l 包括DNA模板2 l Ex Tag DNA聚合酶 0 5 l Ex Tag Buffer 2 5 l dNTP mix 10mM 2 5 l P1 50pmol l P2 50pmol l 各0 2 l dH2O 17 4 l PCR反应条件为94 变性1min 66 退火30sec 68 延伸2min 共30个 循环 最后在72 延伸5min 得到扩增产物 1 4 3 电泳 将所得的扩增产物在1 5 琼脂糖凝胶上进行电泳 电泳条件为90V电泳100min 将得到的电泳结 果放在紫外光下观测其条带 并进行拍照记录 1 5 统计学处理 采用 2检验对所得到的数据进行处理 分析骨性关节炎组与正常对照组的聚蛋白多糖基因多 态性分布有无差异 P 0 05为差异有统计学意义 2 结果 2 1 可变长度重复序列数目确定 聚蛋白多糖核心蛋白基因的外显子 12 上串联重复序列表现出重复数目的多态性 可变长度重复 序列 VNTR 聚蛋白多糖基因 PCR 产物大小与重复序列数目的关系 6 见表 2 1 根据出现核苷酸重 复序列的次数来划分共有 13 种等位基因 表 2 1 PCR 产物与对应的重复序列数目关系 PCR 产物大小 bp 重复序列数目 77513 106018 111719 117420 123121 128822 145925 151626 157327 163028 168729 185832 191533 2 2 PCR 产物电泳 PCR产物电泳结果见图2 1 由图2 1可见 大部分患者和正常对照组的PCR产物的分子量都在 1500bp至2000bp之间 对照表1 1 根据不同分子量的大小可以得到不同的等位基因 成都医学院学士学位论文 3 图 2 1 OA 组与正常组电泳比较 泳道 1 为 Marker 带 分子量标准如图所示 泳道 2 的等位基因是 28 26 泳道 3 的等位基因是 29 27 泳道 4 的等位基因是 29 26 泳道 5 的等位基因是 28 27 泳道 6 的等位基因是 29 27 泳道 7 的等位基因是 29 26 泳道 8 的等位基因是 28 27 2 3 聚蛋白多糖基因多态性分布 OA组与正常对照组的等位基因多态性结果见图2 2 在已得的6个重复序列数中 重复序列 26 27 28有统计学意义 聚蛋白多糖基因重复序列数26 27 28在OA中的表达高于正常组 正常 组以28 29为主 图 2 2 OA 组与正常组重复序列数目频率比较 横坐标表示重复序列数目 纵坐标表示重复序列数目出现的频数在 各自组中所占的百分数 成都医学院学士学位论文 4 3 讨论 骨性关节炎是一种以关节软骨的变性 破坏及骨质增生为特征的慢性关节病 骨性关节炎是一 种慢性关节疾病 它的主要改变是关节软骨面的退行性变和继发性的骨质增生 主要表现是关节疼 痛和活动不灵活 X 线表现关节间隙变窄 软骨下骨质致密 骨小梁断裂 有硬化和囊性变 关节 边缘有唇样增生 后期骨端变形 关节面凹凸不平 关节内软骨剥落 骨质碎裂进入关节 形成关 节内游离体 临床用于治疗骨性关节炎的药物主要作用是缓解症状 控制炎症与疼痛 却不能保护 关节软骨阻止病变的进展 病变最终可发展成为不可逆性的细胞外基质的丢失和慢性残疾 因此我 们需要从病因上寻找治疗方法 骨关节炎的发展过程主要是由于关节软骨的降解 软骨的主要成分 是聚蛋白多糖 聚蛋白多糖基因影响着聚蛋白多糖的品质 研究聚蛋白多糖基因有助于了解聚蛋白 多糖的降解 从而有助于分析发病的分子生物学基础 为疾病的早期诊断 预防和治疗提供帮助 聚蛋白多糖基因的个体差异是影响聚蛋白多糖品质的重要因素 数目可变串联重复多态性 Variable Number of Tandem Repeats VNTR 又称小卫星 DNA Minisatellite DNA 是一种重复 DNA 小序列 为 10 到几百核苷酸 拷贝数 10 1000 不等 VNTR 多态性往往发生 在基因的非编码序列 但是 1997 年 Doege 等 6 发现在聚蛋白多糖核心蛋白基因的外显子 12 上 表现出 VNTR 多态性 而这一区域所编码的正是核心蛋白的硫酸软骨素结合位点 基因多态性的本 质和序列的保守性有关 VNTR 的多态性发生在高度保守区域 不同等位基因的表达可以引起个体 间聚蛋白多糖链长度的差异 从而导致聚蛋白多糖功能的差异 聚蛋白多糖的基因定位于15q26 7 其cDNA由7137个碱基对组成 成熟的聚蛋白多糖的核心蛋 白包括G1 G2 G3 三个折叠形式各不相同的球状区域 G1和G2区域构成核心蛋白的氨基端 G3区 域则位于核心蛋白的羧基端 G1区域包含两个蛋白聚糖重复序列 proteogly can tandem repeat PTR 和一个免疫球蛋白序列 PTR构成了透明质酸结合区域 可非共价结合软骨细胞外基 质 extracellular matrix ECM 中的透明质酸 G2区域与G1区域结构相似 G1和G2区域间的区域 称为球间区 球间区的糖胺多糖结合位点上可以结合约100个硫酸软骨素链和约30个硫酸角质素链 G1和G2间的Glu 373 Ala 374 位点构成了聚蛋白多糖酶的切割位点 而Ser 341 Phe 342 则 是MMP 3的切割位点 人工对聚蛋白多糖酶的切割位点进行突变 可以有效地抵抗该蛋白酶的切割 作用 G3区域的某些氨基酸序列分别和表皮生长因子 ECF C型凝集素 补体相关蛋白 CRP 有 同源性 G3区域 特别是其中的凝集素区域 对于聚蛋白多糖的细胞内的合成阶段起重要作用 它 引导核心蛋白初始链在各细胞器间顺利定位和换位 先天性的G3区域缺失可导致致死性软骨发育不 良 而在聚蛋白多糖被分泌入ECM后 G3对于聚蛋白多糖在细胞外基质内的继续成熟和基质中网状 结构的形成也有重要影响 目前对于 VNTR 等位基因频率和 OA 的关系尚无定论 在以往对手关节炎的研究中发现 患者的 等位基因频率和普通人群相似 以 27 28 为主 等位基因 27 和手关节炎相关 但是和膝关节炎却 没有相关性 8 Kirk 9 通过对 134 例患者进行了为期 50 年的研究证实 在所观察到的 8 个等位基 因中 只有 25 26 27 28 具有统计学意义 并通过多因素方差分析比较等位基因 26 和 25 27 28 发生骨关节炎的风险 结果发现 等位基因 26 增加了风险 在本研究得到的 7 个等位 基因中 等位基因 26 27 28 有统计学意义 聚蛋白多糖等位基因 26 27 28 在 OA 中的表达高 于正常组 提示等位基因 26 27 28 可能与骨性关节炎关系较密切 可能的机制是 具有较短 VNTR 链等位基因的患者具有较少重复次数的聚蛋白多糖的侧链相对较短 其涵养水分的能力也会 相应减少 而其承载负荷的能力相对于正常聚蛋白多糖也较差 具有这种表型的个体在外因作用下 更容易发生关节软骨退行性变 但由于样本量所限 其相关性仍需进一步研究 成都医学院学士学位论文 5 结 论 聚蛋白多糖基因中的重复序列数目 26 27 28 的频率比较中 OA 组高于正常组 由于标本量 的限制 相关性仍需进一步研究 参考文献 1 Collins Racie L A Flannery C R Zeng W et al ADAMTS 8 exhibits aggrecanase activity and is expressed inhuman articular cartilage J Matrix Biol 2004 23 4 219 230 2 Rodriguez Manzaneque J Westling J Thai S et al ADAMTS1 cleaves aggrecan at multiple sites and is differentially inhibited by metalloproteinase inhibitor J Biochem Biophys Res Commun 2002 293 1 501 508 3 Tortorella M D Liu R Q Burn T et al Characterization of human aggrecanase 2 ADAMTS 5 substrate specificity studies in comparison with aggrecanase 1 ADAMTS 4 J Matrix Biol 2002 21 6 499 511 4 Somerville R Longpre J Jungers K et al Characterization of ADAMTS 9 and ADAMTS 20 as a distinct ADAMTS subfamily related to Caenorhabditis elegans GON 1 J J Biol Chem 2003 278 11 9503 9513 5 P Roughley D Martens J Rantakokko The involvement of aggrecan polymorphism in degenration of human intervertebral disc and articular cartilage J European Cells and Materials 2006 11 1 7 6 Doege KJ Coulter SN Meek LM Maslen K Wood JG A human specific polymorphism in the coding region of the aggrecan gene J J Biol Chem 1997 272 21 13974 13979 7 Korenberg JR Chen XN Doege K Grover J Roughley PJ 1993 Assignment of the human aggrecan gene AGC1 to 15q26 u