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中国计量学院现代科技学 院 本科毕业设计 外文翻译 翻译题目 小麦高籽粒蛋白含量基因小麦高籽粒蛋白含量基因 Gpc B1 的物理图谱和的物理图谱和 一种高通量分子标记的研究一种高通量分子标记的研究 外文外文原题 原题 physical map of the highphysical map of the high grah proteingrah protein C Content ontent genegene GPCGPC B1 B1 and development of a and development of a highig throughput molecular markerthroughput molecular marker 学生姓名 鲍威 学号 1030551212 学生专业 生物工程 班级 生工 102 系 计测工程 指导教师 徐晓晖 副教 授 中国计量学院现代科技学院 2014 年 3 月 19 日 小麦高籽粒蛋白含量基因小麦高籽粒蛋白含量基因 Gpc B1 的物理图谱和一种高通量分子标记的研究的物理图谱和一种高通量分子标记的研究 Assaf Distelfeld Cristobal Uauy Tzion Fahima and Jorge Dubcovsky The Institute of Evolution University of Haifa Mount Carmel Haifa 31905 Israel Department of Plant Sciences University of California One Shields Avenue Davis CA 95616 8515 USA These two authors contributed equally to the work 摘要摘要 谷蛋白含量 GPC 是一种人体所需的重要营养物质 它对面团和面包的 质量有重要影响 数量性状基因位点 取自野生二粒小麦 DIC 谷蛋白每千克 增加 14g 其数量性状基因位点定于 6BS 染色体 利用小麦和水稻的共线性 开发小麦区的高浓度图谱并且绘制了数量性状基 因位点作为设计 Gpc B1 的一个简单孟德尔轨迹 使用一个四倍体小麦人工构建 的细菌染色体文库 揭露了一个 Gpc B1 区域约 250bp 物理图谱 构建的两个物理图谱包括两个侧翼标记和一个来自水稻共线性区域完全链 接到 Gpc B1 的潜在的供选基因 讨论了小麦中 在物理和遗传学图距 通过定 位克隆分离基因的可行性之间的关系 揭示了 Xuhw89 高通量共显性标记 在收集的 117 个培养的四倍体小麦和 二倍体小麦中 DIC 的一个 4bp 等位基因缺失 表明对于包含来自野生二粒小麦 高的 GPC 等位基因研究转变到商业化的小麦 这种标记是有用的 关键词关键词 共显性 谷蛋白含量 物理图谱 数量性状基因位点 水稻 小麦 介绍介绍 谷蛋白含量 GPC 是一种人体所需的重要营养物质 它影响面团和面包的 质量 提高小麦谷蛋白的可能方法是从相关的野生小麦属种提取出高谷蛋白基 因 野生二粒小麦 圆锥小麦 170 273 g kg 1 比其它大部分的面包小麦栽培品种 的 GPC 110 170 g kg 1 含量高 因为未使用过高 GPC 基因 所以可作为一种很 有用的资源 Gerechter Amitai Avivi 1978 Grama et al 1983 Levy Nevo et al 2002 查阅啦相关的二粒小麦 在野生小麦调查中发现一种高谷蛋白含量的材料来 源 accession FA 15 3 Avivi 1978 Joppa Sears 1953 Law 1967 用二粒小麦 6B 的全染色体替代物到 Langdon LDN 里 出现了最高的蛋白 密度 谷蛋白含量有效增加与面团质量的增加相关 Joppa et al 1991 与麦粒 产量或麦粒的质量无关 Cantrell Khan et al 2000 此外 与 LDN 品系相比 小麦品种中开 花后的叶中的 GPC 等位基因和可溶性蛋白及氨基酸表现出高水品 Kade et al 2005 其它的研究表明影响小麦族的 GPC 的主要因素可能是位于同源的第 6 组染 色体短臂上的一个主要基因 Blanco et al 2002 坚定了两个四倍体小麦 QTL 的 QPro mgb 6A1 和 QPro mgb 6B 分别位于 6AS 和 6BS 的染色体末端 用 AFLP 标记 一个二倍体小麦6AS染色体臂得数量性状基因位点与扩增片段长度多态性 标记的 XE38M60200相关 Sourdille et al 2003 最终 在很少的 6HS 染色体中 报道了一个在 Hvm74 附近标记主要的数量性状基因位点 See et al 2002 评价一个来自 LDN DIC 6B 和 LDN 之间的重组带换系作图群 RSLs 表明 LDN DIC 6B 的 GPC 增加与 6B 染色体短臂在 Xmwg79 Xabg387 之间 QTL 相 关 Joppa et al 1997 使用田间 10 次重复试验和在 LDN 和 RSL65 之间一系列的 中间的 RSLs GPC 变异来源被被映射到 2 1cm 区域的单个孟德尔基因位点 包 含限制性片段长度多态性 RFLP 位点 Xcdo365 和 Xucw67 该位点被指定为 Gpc B1 Olmos et al 2003 为找到 Gpc B1 的位置 我们以水稻和小麦之间的微共线性 使用水稻基因 组顺序作为 来自对应于小麦表达序列标签 ESTs 区域的新的标记基础 这是我 们能通过 PCR 标记 Xucw79 和 Xucw71 缩小 Gpc B1 基因位点位点到 0 3cm 的区 域 对应于水稻 2 号染色体上的一个 64kh 区间 Nipponbare BAC bacterial artifi cial chromosome AP004061 Distelfeld et al 2004 通过 BAC AP005647 这个 区域被认为在排好序的水稻基因组上 GPC 的遗传学改良一直是小麦面团和面包质量育种项目的常规目标 因为 能从经济上减少 N 肥的需要 然而 由于 GPC 复杂的遗传机制 环境影响大 GPC 和谷物产量的负相关性 Simmonds 1995 传统育种在改良这些特点上非常 缓慢 通过鉴定这些基因 包括影响 GPC 和直接选择分子标记确定的等位基因 不选择低产量而致力于改善 GPC 可以加快进程速度 该研究的特殊目的有 1 更进一步研究在水稻 64kb 区域和直系同源小麦 0 3cm 区域之间包含的 Gpc B1 位点 2 构建包括 Gpc B1 的 6BS 染色体臂区 域的物理图谱 3 开发一个紧密共显性 PCR 标记 Gpc B1 这可已避免酶切扩 增多态性序列 CAPS 标记要求而使用限制性内切酶步骤 并显示系列商业性小 麦的多样性 材料和方法材料和方法 作图群体作图群体 映射群体数量包括来自LDN DIC 6B LDN Joppa et al 1991 交叉的 85纯 合 RSLs 134F2 植物 291 新 F2 植物 总共 935 个配子 在三项田间试验中 首先评估来自第二个群体的重组体的 GPC Olmos et al 2003 但新的重组体线还 未鉴定 GPC 的特征 在现在的水稻 小麦共线性研究中使用了 935 个配子 加利 福利亚大学戴维斯分校 加州 美国大学通过使用三个字母代号 ucw 鉴定了标 记开发 而其它在海法 以色列的大学依据小麦品种的特征基因规则使用 uhw 为实验代号 McIntosh et al 2005 杂交步骤杂交步骤 依据 Dvorak et al 1988 的记录从单个植物的叶中提取了核 DNA BAC 文库 高密度过滤杂交和基因的 Southern 印迹按照 Dubcovsky et al 1994 进行 用 24 种不同的限制性内切酶 Asc I Apa I Ava II BamHI BfaI BglI BstEII BstNI DdeI DraI EcoRI EcoRV HaeIII HhaI HindIII MspI NcoI NdeI SacI Sau3AI SspI StuI StyI and XbaI 消化双亲型 LDN DIC 6B 和 LDN 的基因 并用 Southern 印 迹映射组成 DNA 的 RFLP 比较绘图比较绘图 使用下面的方法 鉴定了来自 64kb 共线性水稻序列的水稻基因和他们的小 麦 纯 合 子 预 测 开 放 阅 读 框 ORFs 从 TIGR automatic annotation http www tigr org 和 Gramene 获得了共线性水稻区域的外显子 内含子界限 通过使用蛋白和 DNA 数据库 EST 数据库 使用 BLASTN BLASTX BLASTNP 对预测编码区 的可能进行了测验 在 TIGR 和 TREP 数据库中研究 BAC AP005647 的水稻阅读 框预测小麦纯合体序列 消除预测蛋白的重复元素 物理图谱物理图谱 RSL65 四倍体小麦 BAC 文库的 28 个高密度过滤器 通过使用 Gpc B1 杂交 探针 发现其上面 30cm 的 DIC 6SBS 染色体片段包含了高 GPC 基因 Cenci et al 2003 通过 PCR 和 southern 印迹验证了正向的 BAC 克隆 为了建立 BAC 克隆 的基因位点区域 用基因特异性引物对 N6AT6B 和 N6BT6A 试验 用 SNapshot labeling kit 试剂盒和毛细管电泳法辨别了 BAC 的正向克隆 BAC 的末端排序的末端排序 BAC 的末端排序使用参照 DNA walk ing SpeedUP kit 说明书方法进行 载 体的引物根据 pIndigoBAC536 BAC 载体序列设计 包括 Outer T7 end 5 GTTTTCCCAGTCACGACGTT 3 Inner T7 end 5 ACGACTCACTATAGGGCGAAT 3 Outer SP6 end 5 TGTGGAATTGTGAGCGGATA 3 and Inner SP6 end 5 CGCCAAGCTATTTAGGTGACA 3 依据试剂盒的提供的 ACP 去捕获 未知的目标序列位点 使用这种方法 我们能扩增 400 5000bp 的片段 这些产 物进琼脂糖凝胶纯化 用 pGEM T 试剂盒克隆 并测序 结果结果 坚坚定了来自水稻低拷贝数量的候选基因定了来自水稻低拷贝数量的候选基因 来自 2 号染色体的 64kb 染色体片段与小麦 0 3cm 的 Gpc B1 区域呈共线性 Distelfeldet al 2004 包括 11 个推测的基因 其中 4 个在 TREP 数据库或 TIGR 数据库未知转座子元件有重要相似性 其中的 2 个与别的蛋白或是植物中的任何 EST 无重大的相关性 通过 Table 1 揭示了五种水稻和小麦的重要相似性 设计 的基因引物成功的扩增出了来自 LDN 的基因 DNA 的 4 个 ESTs 4 个 ESTs 的 PCR 产物作为探针 在 southern 印迹法中杂交用限制性内切酶消化的双亲型 DNA EST BQ609014 杂交结果出现多条带表明该基因是一个多基因家族 而其 余三个 ESTs 出现一条带或两条带 表明是单拷贝或是多拷贝基因 尽管大量的 限制性内切酶被筛选 在双亲线中没有发现多态性 因此 PCR 标记比 ESTs 标 记更成熟 PCR 标记在标记在 BQ789353 BE444066 和和 AL826407 中的应用中的应用 BQ789353 引物扩增出 466bp 产物 通过 466bp UHW83 探针发现了 8 个 确定的 BAC 克隆 只有一个属于 B 基因组 用 HindIII 酶切包含 BAC 的 BAC 770E02 出一个 5500kb 的片段 并测序 通过 CAPS 标记找到了一个单核苷酸多态性 SNP 用限制新内切酶 HaeIII 得到 LDN DIC 6B 的 307bp 和 106bp 片段 LDN 的 413bp 片段 这种多态性被用于 Xuhw83 作图 BE444066 按 表 1 使用设计的引物从 LDN 从得到了 750bp 片段 用限 制性酶 StyI酶切 DIC 得到 432bp 和 117bp 片段 StyI酶切 LDN 得到 549bp 片段 这些与 Gpc B1 位点重要联系多态性被用于 Xuhw83 作图 AL826407 使用 HindIII 消化 AL826407 引物扩增的产物作探针 通过 southern 印迹杂交表明了该基因为 Gpc B1 的候选基因 表 4 总结图示了 8 种纯合子的 RSLs 从 Olmos et al 2003 的深入研究中 知道它们的 GPC 是可以利用的 这些 RSLse 与相近 Gpc B1 基因的发生过重组 Xuhw83 和 Xucw71 含有 Gpc B1 基因 对应于水稻 BAC AP005647 区域 物理图谱物理图谱 RSL65 BAC 文库与 Xucw71 Xuhw83 和 Xuhw84 位点的探针杂交 用 Xuhw84 和 Xucw71 探针找到了 B 基因组的 3 个 BACs A 基因组的 9 个 BACs 而末端的 Xuhw83 探针只杂交了一个 来自 B 基因组的 BAC 克隆和 A 基因组的 7 个 A 基因重叠基因重叠 在最相近的 9 个 BAC 克隆中 1105M18 和 8F18 与 Xuhw84 探针杂交 不与 Xucw71 杂交 有利于相关起源的遗传学作图 在 1105M18 和 8F18 7 个 A genome BACs 未发现基因重叠 由于我们的目的是克隆 B 基因猪的 Gpc B1 基因 对于 A 基因组物理图谱的缺口未做过多研究 B 基因组重叠基因组重叠 Xuhw83末端位点有一个来自B基因组的小BAC克隆 与其它的没有重叠 Xucw71 和 Xuhw84 位点杂交了 HindIII 酶切的 40kb 的片段 这结果表明这两个 基因 位于分离水稻的 31kb 处和分离 B 基因组小麦的 40kb 处 因此这两个基 因不肯能出现遗传作图重叠 依据上述结果 通过 409D13 和 916O17 克隆 我们可推论 Gpc B1 基因位于 BAC 片段中 Xuhw89 的高通量标记的高通量标记 通过 LDN 序列中一个 4bp 多态性 ACTT 复制 该复制在 DIC 缺乏 发现 了 Xuhw89 的是起源 在 6 的聚丙烯酰胺凝胶中分开了这两个等位基因 高通 量标记的开发使得这区域成为关注的重点 之前对 Xucw71 和 Xucw79 Gpc B1 基因标记 将来对其自身基因的标记 需要用限制性内切酶消化 PCR 产物 需 要更高的花费和减少高通量标记 为了确定这种标记在四倍体小麦和二倍体小麦中育种工程中有效性 我们筛 选了收集中的许多普通小麦 表 5 所有的基因型 39 四倍体和 78 二倍体小 麦品种 用用 LDN 等位基因携带的 ACTT 复制特征的 Xuhw89 检测 讨论讨论 草本作物在提供人类干物质总量超过 80 粮农组织 2004 其中小麦占 28 每年 6000 亿吨 因此 小麦籽粒蛋白含量对于人类消耗可利用蛋白数量 上有重要作用 并且这对于 Gpc B1 基因定位克隆是合理的 由于谷物基因组范围巨大 四倍体小麦 13000Mb 二倍体小麦 16000Mb Arumuganathan Brueggeman et al 2002 在这项报 告中 我们鉴定了包括侧翼标记 Gpc B1 基因的两个重叠的 BAC 克隆 表明小 麦种染色体步移的限制性是可能的 然而 这项任务的困难之处是小麦复杂基因 组大量的重复序列 调整为减少染色体步移的努力 高分辨率遗传图谱的巨大投 资 小麦小麦 水稻的微共线性水稻的微共线性 在之前的研究中 通过标记小麦 6BS 染色体 Xucw75 和 Xucw67 的 2 1cm 区域 与水稻 2 号染色体 350bp 区域存在微共线性 Distelfeld et al 2004 除了 末端分析的片段中断外 小麦该区域的 9 个基因和水稻存在共线性 在水稻和小 麦的 Gpc B1 基因区域发现 Xuhw83 Xuhw84 和 Xucw96 存在共线性 小麦的 Xuhw84 基因是水稻 OSJNBa0026E05 19 1 基因同源的基因 所以推 测其可作为 Gpc B1 基因的候选基因 Xuhw84 基因功能未知 但在其第一和第 二个外显子之间有一个保守的 RNA 区 表明该基因可能调控其它基因的表达 通过在小麦 Gpc B1 外作图发现水稻 OSJNBa0026E05 24 基因毗邻与 Xuhw84 基 因 水稻 OSJNBa0026E05 24 基因中断了水稻和小麦接近 Gpc B1 基因的共线性 因此 该机应不能作为 Gpc B1 的候选基因 OSJNBa0026E05 19 1 Xuhw84 基 因可作为水稻 Gpc B1 位点共线性的候选基因 为了证实这个结论 证明 Xuhw84 是 Gpc B1 基因 我们需要对小麦 250kb 区域共线性进行排序 一次来证明没有 其它的小麦基因存在于该区域 通过收集小麦 EST Goff et al 2002 Yu et al 2002 该研究证明了结合了 水稻基因组序列信息是为了建立小麦高分辨的遗传和物理图 Qi et al 2004 通 过观察和其它微共线性研究表明小麦的物理图还需要更进一步的定位克隆 Kilian et al 1997 Yan et al 2004 Gpc B1 基因的物理图谱基因的物理图谱 通过 Xucw71 Xuhw83 和 Xuhw84 基因探针单杂交 被选择的定位克隆平 均数量是 9 7 正如预期估计每个基因组中文库覆盖的 5 1 个基因组量 理论上 A 基因组定位克隆的数量和 B 基因组应该相似 但是大量的 A 基因组克隆在该 特殊区域的被恢复 来自 Gpc B1 基因和 Gpc A1 基因不同的 BACs 代表可能与 随机样品 Gpc B1 区域有关 这是不寻常的 Gpc B1 区域物理和遗传图的距离关系区域物理和遗传图的距离关系 通过作图发现 Gpc B1 位点在 6BS 5 删除区 片段长度在 0 49 0 68 接近 于 Nor2 位点 基于染色体最近位置 我们预想在该区域有高度的物理和遗传图 谱距离比例 随着物理和遗传图距离比例更接近与着丝点 细胞遗传学研究表明 在端粒结合区距离呈现指数型下降 Stein et al 2000 Yan et al 2004 报道Gpc B1区域物理和遗传图距离比例为 1 25 Mb cM 1 250 kb 0 2 cM 应该致力于用定位克隆找到染色体定位目的基 因 仅仅使用粗略的物理和遗传图距离比例来将会面临着准确位置的目的基因定 位克隆 辅助标记辅助标记 MAS 比较 DIC 和 LDN Xuhw89 之间末端物理图 产生了一个缺失多态性 可 用于多态性共线性标记的开发 该标记可以不用限制酶消化 因此用于高通量的 筛选 Gpc B1 基因非常高效 由于这种标记和 Gpc B1 基因紧密连接 所以预期 仅仅只有 1000 个配子 为了表明该基因与 Gpc B1 之间的结合 Xuhw89 标记 表明所有四倍体小麦和二倍体小麦的之间 DIC 的多态性 因此在面团和小麦育 种项目交叉中广阔的使用 在最前沿的育种项目中 可用邻近的 Xucw71 标记验 证这个重组小遗传间隔基因的缺失 Xuhw89 和 Xucw71 标记也能用于减少在 Gpc B1 基因渗入的拖拽连接 除了发现 Xuhw89 标记高通量标记 Gpc B1 基因物理图的完成对进一步 的农艺基因克隆很重要 最后鉴定的 Gpc B1 基因是一个对该基因研究非常好的 标记 更重要的是阐明 GPC 之间不同的多样性 250bp 区域的排序 和确定在 小麦和水稻的重叠的共线性区域是否有另外的小麦基因的缺乏工作仍在继续之 中 中国计量学院现代科技学 院 本科毕业设计 翻译原文 外文外文原题 原题 physical map of the highphysical map of the high grah proteingrah protein C Content ontent genegene GPCGPC B1 B1 and development of a and development of a highig throughput molecular markerthroughput molecular marker 翻译题目 小麦高籽粒蛋白含量基因小麦高籽粒蛋白含量基因 Gpc B1 的物理图谱和一种高通量分子标的物理图谱和一种高通量分子标记的研究记的研究 学生姓名 学生姓名 鲍威鲍威 学号学号 10305512121030551212 学生专业 生物工程 班级 生工 102 系 计测工程系 指导教师 徐晓晖 副教 授 中国计量学院现代科技学院 2014 年 3 月 19 日 中国计量学院现代科技学 院本科毕业设计 外文翻 译 翻译题目 翻译题目 PolyproteinPolyprotein 在拟南芥转基因表达构造不同导致在拟南芥转基因表达构造不同导致产生 两种不同的抗菌两种不同的抗菌蛋白质 外 文外 文 原 题 原 题 Transgenic ExpreTransgenic Expression in Arabidopsis of a ssion in Arabidopsis of a PolyproteinPolyprotein Construct Leading to Production of Two DifferentConstruct Leading to Production of Two Different Antimicrobial Proteins1Antimicrobial Proteins1 学生姓名 鲍威 学号 1030551212 学生专业 生物工程 班级 生工 102 系 计测工程系 指导教师 徐晓晖 副教授 中国计量学院现代科技学院 2014 年 3 月 19 日 摘要 我们在转基因编码裂解嵌合多聚拟南芥表达的方法的开发 该蛋白前体由一个前 导肽和两个不同的抗菌蛋白 AMPS 的 DmA