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第六章克隆策略 基因文库和cDNA克隆 1 克隆策略 2 基因组DNA文库 3 cDNA克隆 1 克隆策略 CloningStrategies 2 GeneLibraries 1 基因文库的概念用重组体DNA技术将某生物的基因组DNA的所有片段随机的连接到载体上 然后转入合适的宿主细胞 通过细胞的增殖而使外源片段扩增 当克隆数量足以把某种生物基因组全部基因包括时 这一组克隆总体称该生物的基因文库 几个概念 基因克隆 基因文库 基因库 2 建立文库的意义 1 在原核生物中克隆 2 在真核生物中克隆 Genomesizesofsomeorganisms kb E coli4 0 x103Yeast Saccharomycescerevisiae 1 35x104Arabidopsisthaliana highplant 7 0 x104Tobacco1 6x106Wheat5 9x106Zeamays1 5x107Drosophilamelanogaster1 8x106Mouse2 3x106Human2 8x106Xenopuslaevis3 0 x106 鸟枪法克隆目的基因遇到的问题 1 工作量大 EcoRI消化的片段平均长4kb 人单倍体基因长2 8x106kb 要制备2 8x106 4 7x105克隆 才能获得目的克隆 2 不易找到完整基因 若基因片段中有EcoRI切点 或基因大于4kb 就难找到完整基因 ClarkeandCarbon方程 1976 ln 1 P N ln 1 1 n N 要获得目的基因所需克隆数 P 获得目的基因的几率 n 基因组大小 克隆片段大小 例 若P 95 人单倍体基因2 8x106kb 克隆片段大小20kb n 2 8x106 20N ln 1 0 95 ln 1 1 2 8x106 20 4 2x105若P 99 N 6 5x105 Cosmid为载体构建基因文库的缺陷 1 菌落杂交不如噬斑杂交清楚 2 菌落扩增后较噬斑容易失真 扩增文库总是会失真的 因此宁可重建新的文库 以尽量不使用扩增后的文库 3 ChromosomeWalking 1 必须确定 Walk 的起点 该点应尽量接近目的基因 2 Walking是沿染色体两个方向发生的 4 Long distancechromosomewalking选用8碱基酶 如NotI 切点少 片段大 48 65536 NotIGCGGCCGCSfiIGGCCNNNNNGGCCPacITTAATTAA 3 cDNACloning AboundanceclassesoftypicalmRNApopulationsNumberofAboundanceSourcedifferentmRNAs molecules cell Mouseliver912000cytoplasmic7003
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