动植物微生物来源的化学药品质量控制+河北省药品检验所　杨梁.ppt

动植物 微生物来源的化学药品质量控制中生物测定法与理化测定法的合理应用Reasonablyapplybiologicalandphysical chemicalassayandtestforthedrugs whichextractedfromanimalandplantandmicrobes河北省药品检验所杨梁HebeiprovincialInstitutefordrugcontrolYangLiang 摘要ABSTRACT科学合理地应用生物测定法 理化测定法 制订能够有效控制药品质量的药品标准 不断提高药品的有效性和安全性是药品标准工作永恒的目标 Workoutdrugstandard thatisabletocontrolqualityofdrugseffectively toimprovesafetyandeffectivenessofdrugsubstancesanddrugproduct iseternalgoalfordrugstandardwork 控制药品质量的实质就是要控制原料药和制剂中的药物活性成分分子在其有效期内符合临床需要的药物构效关系并保持其物理稳定性 化学稳定性 治疗学稳定性 微生物学稳定性和毒理学稳定性 Controlmolecularofactivitypharmaceuticalingredientinthedrugsubstancesandproducts inessenceofcontrolquality conformtostructure activityrelationshipandmaintainitsphysicalstability chemicalstability therapeuticstability microbiologicalstabilityandtoxicologystability beforetermofvalidity 因此 我们认为在方法学研究中应该注意以下3点 1 生物测定法是不可替代的方法 2 理化测定法检测结果必须体现药物的真实活性或效价 3 科学合理地综合运用生物测定法和理化测定法 才能有效控制药品质量 Thereforewemustbeattentiontofollowing3problems whenstudyanddesignformethodology 1 Biologicalassayandtestistheirreplaceablemethod 2 Determinationresultsofphysicalandchemicalassaymustbeindicatingtrueactivityorpotencyofdrug 3 Onlyscientificallyandreasonablyapplybiologicalandphysicalandchemicaltestmethods drugqualityiscontrolledeffectively 一 生物测定法是无可替代的药品检测方法 Biologicalassayistheirreplaceablemethodofdrugtest 药物的分子结构及其构型 构象决定着药物的生物学特性和理化特性 特别是药物制剂中药物分子的结构是否稳定 其构型 构象对于治疗或预防疾病是否有利 其降解产物 可能的外来物质会对人体产生何种危害 而检测与 评价其特性所导致的生物效应 包括对疾病的治疗作用与可能发生的不良反应 最直接的方法就是生物测定法 ThemolecularstructureofAPIinthedrugproductanditsconfigurationandconformationdecideditsbiological physicalandchemicalcharacteristics especiallymustbeattentionforthat thestructureanditsconfiguration andconformationwhetherornotstabilize whetherornotadvantageousfortheresistdiseasesorpreventdiseases itsdegradationsubstancesandforeignmaterialhowhazardforhumanbody Biologicalassayandtestaremostdirectmethods whichcantestandevaluatebiologicaleffect includingtherapeuticactionandundesirableaction 1 生物测定法是直接体现真实治疗作用的方法Biologicalassayisthemethodofdirectlyreflectingarealcureactionofdrugproduct 缩宫素源自猪牛羊垂体后叶的提取物 是临床用于引产 产前子宫收缩不良和产后及子宫肌瘤术后的止血药 其低剂量可增强子宫节律性收缩 高剂量则可使肌层内血管受压而止血 因而至今在临床广泛应用 检测时测定的子宫肌肉收缩的高度与缩宫素的效价单位数相关显著 所以其大鼠离体子宫测定法直接代表了临床疗效 Oxytocinisextractedfromhypophysinumofpig cattleandsheeporgoat Oxytocinistreatingforinductionoflabor improveuteruscontractsandpostpartumstypticorafterresectionofuterusmyoma itslowerdosemayimpeltheuteruscontract anditshigherdosemaycontrolpostpartumuterinebleedingbypressingvesselinmuscleandthereforeoxytocinisapplyingwidelyinhospitals ThepotencyofoxytocinisestimatedbycomparingthecontractioneffectproducedonisolatedratuteruswiththatproducedbyPosteriorPituitaryorOxytocinStandard Itreflectstheeffectofclinic Thecontractionofuterushastheremarkablecorrelationwiththepotencyofoxytocin 图1 缩宫素使子宫收缩高度发生变化的记录比较图Figure1 comparingthecontractioneffectproducedonisolatedratuteruswiththatproducedbyPosteriorPituitaryorOxytocinStandard 表1 缩宫素使子宫收缩高度发生变化的数据表Table1 datecomparingthecontractioneffectproducedonisolatedratuteruswiththatproducedbyPosteriorPituitaryorOxytocinStandard 表2 缩宫素效价测定的生物统计和可靠性测验结果Table2 biologicalstatisticalresultsofthecontractioneffectproducedonisolatedratuteruswiththatproducedbyPosteriorPituitarywithOxytocinstandardpotency 2 生物测定法是直接代表药品安全性的有效方法Biologicalassayistheeffectivemethodthatdirectlyindicatedthedrugsafety 洋地黄毒苷是一个源自紫花洋地黄的强心苷 其有效量为0 05至0 1mg 其极量为1 2mg 即有效量和中毒量之间距离很小 用鸽法进行生物测定 可以直接有效地测定其效价和中毒剂量 从而有效控制其制剂含量 为临床治疗慢性心衰并防止洋地黄中毒 提供安全保证 DigitoxinisakindofcardiacglycosidecomefromDigitalispurpureaL Itseffectivedoseisfrom0 05to0 1mg Itsmaximumdoseis1 2mg Thedistanceissosmallfromeffectivedosetopoisoningdose ThepotencyofdigitalismaybedeterminedbycomparingtheminimumlethaldoseitproducedbypigeonswiththatproducedbyDigitalisStandard Thismethodcanbeusedtoeffectivelycontrolthecontentsofapreparationofdigitalisandthengiveasafetytobeatreatmenttoheartfailureandavoiddigitalispoison 3 对于硫酸庆大霉素等多组分抗生素 由于其各个组分HPLC法测定法的响应值与其效价的量效关系尚不明确 所以在用理化测定法控制其组分比例的同时 还必须用微生物测定法测定各组分的总效价 以控制其总体活性 BecauserelationshipofthesepeaksrespondingbyHPLCofeveryconstitutewithitsdose effectrelationshipofpotencyisnotexplicitnessinordertocontrolbiologicalactivity thereforemustbedeterminatetotalpotencybymicrobiologicalassayofantibiotics simultaneouslydeterminateproportionofconstitutesbyphysical chemicalassay forexamplegentamicinsulfateetc ofmulti constituteantibiotics 表3 硫酸庆大霉素各组分和效价测定结果表Table3 assayresultsofratioofgentamicincomponentsandtotalpotency 二 理化测定法的检测结果必须真实体现被测物的生物活性和安全性Thetestresultsofphysicalandchemicaldeterminationmustbetrulyembodiedthebiologicalactivityandsafetyofthesample 1 为了保护环境 保护动物 我们应当努力研究取代生物测定法的理化分析法 Inordertoprotecttheenvironmentandanimals weshouldstudyphysicalandchemicalanalysismethodshardtoinsteadofbiologicalassays 2 采用的理化测定法必须用生物测定法验证与评价 即理化测定法检测目标物及其测定结果必须能体现其生物活性 Analyticaltargetcomponentsanddeterminableresultbythephysicalandchemicaldeterminationmethodmustbeabletoverifyandevaluatedbybiologicalassays namelytheresultsofphysicalandchemicaldeterminationmustbeabletoembodythebiologicalactivity FB0601是一个 内酰胺类半合成抗生素 其申报标准中的含量测定方法为中和滴定法 我们以金黄色葡萄球菌 CMCC B 26003 为检定菌 pH6 5II号培养基和pH6 0缓冲液 用微生物检定法测定了其效价 结果表明 不同生产厂家样品的中和滴定法测定结果与测得效价之间差异显著 FB0601isahalf synthetic lactamantibiotic usingneutralizationtitrationtodeterminethecontentinitsapplicationregisteredstandard WithStaphyl aureus CMCC B 26003 astestorganism pH6 5IIasmedium pH6 0sterilebuffer itstiterevaluationbymicrobiologicalassayofantibiotics Theresultsshowthat significantdifferencebetweentiterevaluationandtitrationcomingfromdifferentmanufacturerssamples 继而 我们采用ODS柱 以磷酸盐缓冲液 乙腈 75 25 为流动相 流速每分钟1ml 紫外检测波长225nm的HPLC法检测 结果发现在8批不同工艺的产品中 既有单个主要色谱峰 A 者 也有两个主要色谱峰 A B 者 凡仅有单个色谱峰A者 其效价均远高于有两个色谱峰A B者 见下图 Then weadoptHPLC ODScolumn phosphatebuffer acetonitrile 75 25 asmobilephase flowrate 1ml min anddeterminationwavelength225nmbyUVdetector Wefoundbothsingleprincipalpeak A andtwoprincipalpeaks AandB ineightproductiontechnology Onlysingleprincipalpeak A itspotencyarefarthantwoprincipalpeaksofAandB seechartasbelow 图2 FB0601的HPLC图 上图为仅有单一组分峰 下图为有两个主组分峰 Figure2 determinedresultsofFB0601byHPLC top singleprincipalpeak A below twoprincipalpeaks AandB 显而易见 该HPLC法的专属性和与体外抗菌活性的相关性均高于中和法 Obviously themethodofHPLCisbetterthantitrationmethodinspecificityandcorrelativityofantimicrobialactioninvitro 三 科学合理地综合运用生物测定法和理化测定法Usereasonablyandcompositelythebiological physical chemicalassayandtest 为了既保护环境 节约资源 又确保药品标准能对药品的有效性 安全性和质量稳定性 包括物理 化学 治疗学 微生物学和毒理学稳定性 实施有效控制 我们认为 在制订或修订药品标准时 必须科学合理地综合运用生物测定法和理化测定法 Theauthorthink whenweworkoutdrugstandard wemayusereasonablyandcompositelythebiologicaltestingmethodsandphysical chemicaltestingmethodstomakethevalidity safety andstabilityofdrugqualityforsureandtoachievethegoalofprotectingenvironmentandresourceeconomyatthesametime 1 不断改进理化测定法的专属性并采用生物测定法对其验证与评价 Improvecontinuouslythespecificityofphysical chemicalmethodandusebiologicalmethodtoverifyandevaluate 1 方法学研究的专属性不但是指可能存在的某组分 如杂质 降解物 基质等 时 对被分析物准确可靠测定的能力 还应指药物活性成分的分子必须是具有可靠临床疗效的特定构型 构象 包括多晶和异构 和足够的纯度 并具备经生物测定法实验确证的控制能力 Thespecificityofmethodologyresearchisnotonlymeanstheabilitytoassessunequivocallytheanalysisinthepresenceofcomponentswhichmaybeexpectedtobepresent typicallythesemightincludeimpurities degradedmaterials matrix etc accuratelydependablytheanalyzedsubstance butalsotheabilitytocontrolthemoleculeofactivepharmaceuticalingredienttohavespecialconfigurationandconformationthatincludespolymorphandisomerofmolecule andenoughpurity Atthesametimethemethodshouldhavedefiniteproofbybiologicalmethod 2 到目前为止 药物的构效关系都是用单晶X射线衍射法与生物测定法结合而确定的 因此 结合临床治疗学效果 已有的构效关系和生物测定法对其进行验证与评价 可为分析方法学研究提供选择和改进的依据 Currentmedicine sstructure activityrelationshipisdeterminedbysinglecrystalX raydiffractionandbiologicalmethod socombiningclinictherapeuticeffectwiththeexistingstructure activityrelationshipandbiologicalmethodtoverifyandevaluateitmaysupplyachoosingandimprovingfoundationforanalysisresearch 3 从对于药品的有效性 安全性和稳定性等都能够实施有效控制的目标来说 没有一种方法可以同时识别药物的生物及理化特性 换言之 没有一种方法是万能的 所以 只能综合应用生物测定法和理化测定法 Thereisnoall powerfultestingmethodtoidentifybiologicalandphysical chemicalcharacteristicofdrugatthesametimetothegoalofcontrollingdrugsubstancesanddrugproductsefficacy safety andstability Whereforeweshoulddoistocombinethebiologicaltestingmethodandphysical chemicaltestingmethod 2 加强对生产过程中可能产生的有关物质包括原料和辅料的同系物 降解物 异构体等和外来物质 包括包装材料及提取 精制过程中混入的杂质等 尤其要格外关注HPLC法之紫外检测器不能识别的有关物质的控制和预防 Wealsoneedstrengthentoreinforcethecontrolpossiblerelativematerialsincluderawmaterials homologouscompoundofaccessoriesanddegraded materials isomerandforeignmaterialetc thatincludesparkingmaterialsandimpurityfromextractingandrefiningprocesses especiallypayattentiontorelativematerialthatcan tbeidentifiedbyultravioletdetectoretc ofHPLC 3 为了保护环境 节约资源和减少污染 应按真实 准确 安全 可靠与精简高效的方针 综合运用生物测定和理化测定法设计和制定药品标准 Forprotectingenvironment resourceeconomyanddecreasepolluteraccordingtoguidelineprinciple whichconformtotrue accurate safety confidence simplifyandefficient guidingprinciple wemayreasonablyapplybiologicalandphysicalandchemicalassayandtest todesigndrugstandards 1 鉴别 Identification IR法Infraredspectroscopy盐酸林可霉素具有多晶现象 两种晶型的红外光谱行为差异显著 为此 我们进行了晶体结构研究 Lincomycinhydrochlorideishavingmonograph Itspatternoftwocrystalformsaredifferentonmiddleinfraredspectrum becausewestudycrystalstructureofitstwocrystalforms a晶型I b 晶型 a crystalform b crystalform 图3盐酸林可霉素两种的扫描电镜照片Figure3 photographsofCrystalpolymorphsoflincomycinhydrochloridebyscanelectronmicroscopy 单晶 射线衍射测定结果Resultbysinglecrystal raydiffraction其晶型I属正交晶系的P22121空间群晶胞参数为a 6 1670 31 b 18 5350 8 c 20 6170 5 每个晶胞内含有4个盐酸林可霉素分子与4个水分子 化学计量式为C18H34N2O6S HCL H2O 计算分子量为461 01 林可霉素分子五元环 古液酸 为信封式构象 六元环 林可霉糖 为椅式构象 1位疏甲基 4位羟甲基为直立键 2 3位羟基及5位取代基均为平伏键 其分子内氢键为O 4 O 2 2 8295 分子间氢键为O 1 O 3 1 x y z 2 9235 水分子与林可霉素分子间氢键 O w1 O 2 2 x 1 2 y 1 2 z 2 8849 晶态下分子以氢键力和范德华力维持空间稳定排列 见下图 ThecrystalformIbelongsorthorhombicsystem inspacegroupP22121 Z 4 withunitcellparametersa 6 1670 31 b 18 5350 8 c 20 6170 5 stoichiometricformula C18H34N2O6S HCL H2O calculatedmolecularweight 461 01 图4盐酸林可霉素晶型 分子立体结构投影图Figure4 stereo structureperspectivediagramoflincomycinhydrochloridemolecularofcrystalform 图5盐酸林可霉素晶型 晶胞沿a轴的投影图Figure5 perspectivediagramofcrystalcelloflincomycinhydrochloridecrystalformIalongthea axis 晶型II属单斜晶系 空间群为P21晶胞参数a 5 243 1 b 33 894 2 c 13 633 1 95 212 4 每个晶胞内有4个盐酸林可霉素分子 每个盐酸林可霉素分子结合1个水分子与另一个一水盐酸林可霉素分子复合 再结合0 5个水分子 即其化学计量式为 C18H34N2O6S HCl H2O 2 H2O 0 5 计算分子量为461 01 ThecrystalformIIbelongsmonoclinicsystem inspacegroupP21 Z 4 withunitcellparameters a 5 243 1 b 33 894 2 c 13 633 1 95 212 4 stoichiometricformula C18H34N2O6S HCl H2O 2 H2O 0 5 calculatedmolecularweight 461 01 其分子结构中五元环 古液酸 六元环 林可霉糖 及1 4位取代基 2 3位及5位取代基键构型虽均与晶型 相同 但因不对称单位中两林可霉素的五元环空间取向不同 使其互为构象异构体而不能叠合 该晶型盐酸林可霉素分子中O 4 在晶中占有两个位置 C 4 C 20 C 18 C 19 C 20 原子因其部分位置无序 温度因子稍高 该晶型无分子内氢键联系 分子间氢键联系为 N 10 O 5 x 1 y z 2 8730 O 5 Ow 2 x y z 2 6835 N 10 O 5 x 1 y z 2 9572 O 2 O 3 x y 1 z 2 8274 该晶型晶态下靠氢键力和范德华力维持空间的稳定排列 见下图 图6盐酸林可霉素晶型 不对称单位中两个分子的叠合图Figure6 diagramoftwomoleculesplyintheasymmetricunitoflincomycinhydrochloridecrystalform 图7盐酸林可霉素晶型 的分子立体结构投影图Figure7 stereo structureperspectivediagramoflincomycinhydrochloridemolecularofcrystalform 图8盐酸林可霉素晶型 晶胞内分子沿a轴方向的投影图Figure8 perspectivediagramofcrystalcelloflincomycinhydrochloridecrystalform alongthea axis 粉末 射线衍射测定结果Determinationresultbypowder raydiffraction经对晶型 与晶型 单晶X射线衍射计算 所得粉末X射线理论值及将其分别研碎后粉末X射线衍射实测值比较 晶型 与晶型 粉末X射线衍射谱的主要区别为 晶型 在2 角6 44 14 32 和19 32 处有强衍射峰 而晶型II则在2 角5 18 和10 4 有强衍射峰 见下图 b 晶型 b Crystalform 图9盐酸林可霉素两种晶型粉末的X射线衍射图Figure9 X raypowerdiffractionpatternofpolymorphsoflincomycinhydrochloride a 晶型Ia CrystalformI 图10盐酸林可霉素原料的粉末 射线衍射图Figure10 diagramoflincomycinhydrochloridedrugsubstancesbyPXRD 用来制备晶型 晶型 单体的原料经X射线衍射分析 则系以晶型 为主 同时含有少量晶型 的混合物 其粉末X射线衍射图如下 由图可见 a 晶型 的主要衍射峰在原料粉末X射线图中均明显出现 PrincipaldiffractionpeakofcrystalformIappearinX raypowerdiffractionpatternofdrugsubstances b 晶型 的主要衍射峰在原料粉末X射线衍射图中亦出现 PrincipaldiffractionpeakofcrystalformIIappearinX raypowerdiffractionpatternofdrugsubstances 红外与近红外光谱测定结果 见下图 Fig11infraredspectrumofcrystalformIoflincomycinhydrochloride Fig12infraredspectrumofcrystalformIIoflincomycinhydrochloride Fig13nearinfraredspectrumofCrystalformIandformIIoflincomycinhydrochloride 鉴于晶型II比晶型I的实测效价总是高出大约50单位 两种晶型均为有效晶型而且差别不大 根据我国20年来对其进行考察的实际结果 故将红外分光光度法鉴别的压片法改为石腊糊法 不再仅限定晶型I BecausecrystalformIIpotencymorethancrystalformI50units mg disparitybetweencrystalformIandcrystalformIInearly thusdeterminethatoil mulltechniquereplacepressedhalidedisktechnique HPLC法Highperformanceliquidchromatography盐酸林可霉素原料药中可能会有7 差向林可霉素 a 酰胺差向林可霉素 林可霉素B N 去甲基林可霉素等同系物 其抗菌活性均远低于林可霉素 我们经过四种HPLC法的试验比较和色谱条件的优化 建立了符合ICH对分析方法要求的HPLC法 该法可分离出林可霉素 7 差向林可霉素 a 酰胺差向林可霉素 林可霉素B及待进一步确定结构的同系物等有关物质等6个有关物质 见下图 Lincomycinhydrochloridemaybeaccompanied7 epilincomycin a amideepimerlincomycinBandlincomycinotherhomologouscompounds theirpotencyaresolowerthanLincomycin wecompared4HPLCmethodsbytestsandoptimizedchromatography themethodcanseparatelincomycin 7 epilincomycin a amideepime lincomycinBandalincomycinhomologouscompoundetc 图14 林可霉素有关物质的HPLC图Fig14 lincomycinhydrochloriderelatedsubstancesbyHPLC 检查 水分Water 盐酸林可霉素两种晶型热重分析结果 晶型I单晶X射线衍射测定所得化学计量式为C18H34N2O6S HCl H2O 依该式计算理论含水量为3 91 我们用费休氏水分测定3次 所得均值为4 15 采用热重分析法其失重率为3 482 均基本符合其理论值 见下图 DeterminatestoichiomertricformulaofcrystalformIisC18H34N2O6S HCl H2O theorycontentofwateris3 91 determinatevalueis4 15 byKarlFischermethod loseweightis3 482 byTGA theyareconformtotheorycontentofwater 图15盐酸林可霉素两种晶型的热重分析图Fig15 TGAcurveoflincomycinhydrochloridetwocrystalforms 由图可见晶型II的热重曲线与晶型I不同点是它先失去一个分子水 尔后才失去两个分子共用的0 5个分子水 Twocurvesaredifferent whichTGAcurvesshowsthatformIIpreviouslyloseonecrystallinewater hereafterlosehalfcrystallinewater 费休氏水分测定考察结果 经我们考察12个生产厂家76批产品的结果 均为晶型 为主 并存在少量晶型 的混晶 但水分均在6 0 以内 Examine76batchesOfLincomycinhydrochloridesamples thatproducedby12manufactory whichresultsshowstheirprincipalcrystalformsareFormI sametimewithalittleofformII butwatercontentsarenotmorethan6 0 有关物质 Relatedsubstances 制定药品标准有关物质检查项时应关注的问题 1 该药品中都有哪些物质或成分 2 都是什么物质或成分 其分子结构如何 3 这些物质或成分之间有无相互作用 4 这些物质或成分及其可能的相互作用产物对人体有什么作用 5 使用哪种方法能够准确检测它们 6 如何确定其限度 Problemsshouldbeconcernedthetestmethodofrelevantmaterials whentheworkoutdrugstandards 1 Whatmaterialsorcomponentsarecontainedindrugs 2 Whatarethesematerialsorcomponents Whatarethesemoleculesstructure 3 Whetherornottheyareinteractionbetweenthesematerialsorcomponents 4 Whatfunctionofthesesubstancesorcomponentsandpossibleinteractionproductforhumanbody 5 Whatmethodcanbeusedtotestthemaccurately 6 Howrestricttotheirsquantity 华北制药集团新药研究开发中心牛长群等近期采用液相色谱 质谱联用仪对该厂林可霉素原料中的林可霉素 差向林可霉素 林可霉素B 差向林可霉素B及一个同系物做了HPLC与MS验证 其HPLC DAD ESI离子流图与MS图谱分列如下 NiuChangqun pharmaceuticaldevelopmentcentreofNCPC measurelincomycinhydrochlorade thatmadeinNCPCtructuresoflincomycinanditsrelatedsubstancesincluding lincomycin epilincomycin lincomycinB epilincomycinBandalincomycinhomologouscompoundbyHPLC DAD andLC MS seechartasbelow 我们认为 在制定药品标准时 对于林可霉素有关物质 由于相同分子量的同分异构体较多 例如与林可霉素分子量相同者就有7 差向林可霉素 a 氨基林可霉素 与林可霉素B分子量相同者就有N 去甲基林可霉素等 所以 他们的分子结构还需进一步确证 Theauthorthink becausemoleculeswithsamemoleculeweightaresomore intherelatedsubstancesoflincomycin forexamplelincomycinand7 epilincomycin lincomycinanda amideepimer lincomycinBandN demethyllincomycinetc whenworkoutdrugstandard thereforetheirsmoleculesstructuresmustbeIdentifyfurther 图16 上图为林可霉素HPLC DAD 图 下图为ESI总离子流图 Fig16 top analyticalresultoflincomycinhydrochloridebyHPLCwithDAD belowESItotalionflowbyLC MS 图17 上图为林可霉素质谱图 下图为差向林可霉素质谱图Fig17 top analyticalresultoflincomycinhydrochloridebyLC MS belowanalyticalresultofepilincomycinhydrochloridebyLC MS 图18 上图为林可霉素B质谱图 下图为差向林