动物克隆技术-复旦本科生06-09.ppt

动物克隆技术 一 胚胎工程二 胚胎移植技术三 动物克隆技术四 核移植技术的应用 一 胚胎工程 1 受精卵胚胎胚胎分裂 着床着床前胚胎 胚胎 着床后胚胎 胎儿 胚胎细胞体细胞 四细胞 囊胚 胎儿 成体 受精卵 两性配子的结合 细胞分裂 细胞分化 胚层形成和组织发生 器官系统新的个体 特定基因表达 2 动物胚胎学 输卵管 输卵管液 子宫 MammalEmbryoBio engineering 出生 培养箱 培养液 子宫 人造子宫 出生 3 动物胚胎工程 动物胚胎工程定义 对配子或胚胎进行人为地干预 使其环境因素 发育模式或局部组织功能 发生量和质的变化 这一综合技术 统称为胚胎生物工程 或简称为胚胎工程 embryoengineering 广义而言 胚胎工程包括所有的对配子和胚胎的操纵以及人为地干预的现代方法 MammalEmbryoBio engineering 4 动物胚胎工程主要技术 体外受精 显微受精与体外培养技术胚胎移植技术卵母细胞与胚胎冷冻保存技术嵌合体动物制备技术性别选择与鉴定技术转基因动物制备技术克隆技术 二 动物胚胎移植技术 供受体的情期同步 超数排卵与受精 受精卵的回收 胚胎质量的评价 移植 妊娠 动物 或人 出生 波尔山羊手术冲卵 检卵 4细胞 2细胞 波尔山羊胚胎 波尔山羊胚胎移入奶山羊输卵管 移植后缝合的创口 40日龄B超诊断图 波尔羊羔与其养母 莎能奶山羊 动物的胚胎移植技术应用非常广泛 试管婴儿 人的胚胎移植 第一代试管婴儿 IVF 第二代试管婴儿 ISCI 第三代试管婴儿 遗传病诊断 北京时间10月4日下午5点30分 2010年诺贝尔生理学或医学奖揭晓 英国科学家罗伯特 爱德华兹 RobertEdwards 因发展体外授精疗法获奖 罗伯特 爱德华兹1925年出生于英格兰曼彻斯特 二战中服完兵役后 他进入威尔士大学和爱丁堡大学学习生物学 1955年获得博士学位 论文内容为小鼠胚胎发育 1958年他成为英国国立医学研究所研究人员 开始了对人类授精过程的研究 从1963年开始 爱德华兹相继在剑桥大学和BournHall诊所 世界首个试管授精中心 工作 BournHall由爱德华兹和PatrickSteptoe所建立 爱德华兹担任其研究主任多年 爱德华兹同时还是授精研究领域多本顶尖期刊的编辑 爱德华兹目前是剑桥大学名誉退休教授 早在1950年 爱德华兹就认为IVF可以有助不育症的治疗 通过系统的研究工作 他发现了人类受精的重要原理 并成功实现人类卵细胞在试管 或者更确切地说 是细胞培养皿 中受精 1978年7月25日 世界上第一例试管婴儿的诞生 就是对爱德华兹的不懈努力的最好表彰 在接下来的几年内 爱德华兹和他的同事将IVF进行改良 并将其与世界分享 到目前为止 因为IVF而得以出生的人大约有四百万 他们中的许多人现已成年 甚至有的已为人父母了 在罗伯特 爱德华兹的引领下 对IVF疗法的研究获得了许多重要发现 一门新医学领域也由此诞生 他的贡献代表着现代医学史上的一座里程碑 三 克隆技术 一 克隆概念 1 何为克隆 我们生活中还有 我们生活中还有 四细胞 囊胚 胎儿 成体 2 什么是有性繁殖 与无性繁殖的区别 3 实现哺乳动物无性繁殖的途径 第一种途径 孤雌生殖第二种途径 胚胎分割第三种途径 细胞核移植 第二节胚胎分割 胚胎分割是指把着床前胚胎经过切割一分为二 或一分为四 乃至一分为八 然后把这种半胚 1 4胚 和1 8胚移入受体生殖道后发育成个体 关键 一是分割后的胚胎能否发育成个体 二是分割后获得的效率 1 分割后的胚胎能否发育成个体 每个受体仅移一个半胚 2 分割后获得的效率 理论能够提高一倍 分割 每个受体移二个半胚 整胚移植 每个受体移一个胚胎 表明 按每个胚胎的产犊数 胚胎分割的产犊效率较整胚移植可提高20 左右 其效率的提高主要表现在妊娠率的提高 显然是和每头受体移植胚胎数有关 其次是半胚移植后的同卵双胎 乳牛胚胎分割和常规整胚胎移植效率比较 3 胚胎分割方法 1 针切割 2 刀切割 3 胚胎切割中存在的问题 1 切割胚胎的发育期 显然胚胎切割后的存活率是和胚胎具有的细胞数有关 2 胚胎分割次数和分割胚的发育 从理论上讲分割次数越多其可获得的同卵多胎越多 事实上胚胎最终发育成个体必须有一个最低细胞数 3 胚胎质量 用于分割的胚胎其质量显然影响效率 4 分割胚胎在体外操作时间 在胚胎质量良好和合适的培养条件情况下 分割胚胎在体外的时间并不影响半胚的出生率 5 胚胎切割的在家畜生产中的应用 1 分割胚可以发育成个体 半胚能提高生产率 四分胚和八分胚则因分割胚细胞数减少而降低 无实用价值 2 胚胎分割可获同卵双胎 克隆动物 其效率在30 左右 首选是把一个卵对切后二个半胚同移于一个受体 3 胚胎分割技术可用于胚胎的基因型鉴定 Nature 2004 428 22 860 a b 孤雌发育的小鼠 c d妊娠19 5d的孤雌发育的小鼠 死亡 e 孤雌发育的小鼠自然繁殖的后代 第三节孤雌发育 概念 是指雌性生殖细胞不经受精作用而直接成胚的一种生殖方式 作为一种特殊的遗传生殖发育形式 第四节核移植动物 一 核移植动物制备方法 制备核移植动物主要有三种方法 核移植动物制备方法 去 移核操作过程图 去核前 去核中 移核前 移核中 融合 体内培养的NT羊胚胎 克隆猴技术路线 克隆人 核移植动物制备方法 克隆动物制备程序 A B C D Day7blastocystwithoutzona HandmadesomaticcellclonedbovineembryosdevelopinginWOWsatday2 a day3 b day4 c day6 d afterreconstruction 二 种间核移植 何为种间核移植 克隆 何为亚种间核移植 克隆 为什么要做种间核移植 三 核移植动物研究进展 一 异种体细胞核移植动物进展 供核 印度野牛供质 家养奶牛卵母细胞受体 家养奶牛 CLONING Volume2 Number2 2000 naturebiotechnology VOLUME19 OCTOBER2001 供核 殴洲盘羊供质 绵羊受体 绵羊 SCIENCEVOL30018APRIL2003 供核 白臀野牛供质 家养奶牛卵母细胞受体 家养奶牛 二 种内体细胞核移植动物进展 核 Nature 1997Feb27 385 6619 810 3 Viableoffspringderivedfromfetalandadultmammaliancells Reconstitutedembryos left aftercoculturewithBRLcellsinvitroor2days X200 Rhesusmonkeyinfants right producedbynucleartransfertechnology BiolReprod 1997Aug 57 2 454 9 Full termdevelopmentofmicefromenucleatedoocytesinjectedwithcumuluscellnuclei Nature 1998 394 6691 369 74 Clonedmice a Thefirstsurvivingclonedmouse Cumulina born3October1997 atfourweeks foreground withherfostermother b Cumulinaat2 5monthswiththepupssheproducedfollowingmatingwithaCD 1 albino male c TwoB6C3F1 derived cloned agoutiyoung centre infrontoftheiralbinofostermother CD 1 andaB6D2F1oocytedonor black right Thetwoagoutioffspringinthecentreareclones identical twin sisters oftheagoutiB6C3F1cumulusdonorshownontheleft andaretwooftheoffspringdescribedinseriesC seetext Tetra anonhumanprimatequadrupletclonedfromaneight cellembryobysplitting Science 2000Jan14 287 5451 317 9 PNAS 97 3 990 995 2000 Theclonedcalvesandthe17 year oldbullusedforcloning Clonedcalvesfromlefttoright Pass15 A Pass15 B Pass10 B andPass10 C Clonedrabbitsproducedbynucleartransferfromadultsomaticcells NatureBiotechnology2002 366 369 A Clonedrabbit0107withcorrespondingcontrols A1 expressionoftheEGFPproteinfluorescence arrowhead detectedbyconfocalmicroscopyfromhairfolliclesobtainedfromanearbiopsyat1monthofage A2 thesameundertransmissionlight A3 amplificationsoftheEGFPtransgene PCR2 andoftheexon10oftheCFTRgeneusedasDNAqualitycontrol PCR1 withexpectedfragmentsizesof240bpfortheCFTRgeneand350bpfortheEGFPtransgene Thisconfirmsthatrabbit0107anditslittermate107b whodied1dayafterbirth werederivedfromthedonorcumuluscell B1 B2 Threeotherrabbitsfromtwodifferentlitters rabbitsinB1havenowprovedtobefertile Targeteddisruptionofthealpha1 3 galactosyltransferasegeneinclonedpigs NatBiotechnol 2002Mar 20 3 251 5 a Adultfemalecatthatsuppliedcumuluscellsfornucleartransplantation ThecellswereculturedinDMEM F12mediumfor5daysat37 Cuntilconfluent micromanipulationwasusedtoenucleateovaobtainedafterroutineovariohysterectomyandtotransferthedonor scumuluscellsintotheperivitellinespace Enucleatedovaandcumuluscellswerefusedbyelectrofusion asecondelectropulsewasappliedtoactivatetheoocytes b Thesurrogatemother asynchronizedrecipientofthreeclonedembryos producedoneclonedkitten whichwasdeliveredbycaesariansection66daysafterembryonictransfer Forfurtherdetails seesupplementaryinformation Acatclonedbynucleartransplantation Nature415 859 21February2002 doi 10 1038 nature723 Productionofclonedgoatsafternucleartransferusingadultsomaticcells BiolReprod 2002Jan 66 1 199 203 a Granulosacelldonor IDno 356 b Granulosacellclone GC2 1 derivedfromthedonorgoatshownina c Granulosacelldonor IDno 358 d Granulosacellclones GC2 3 GC2 4 GC2 5 andGC2 6 derivedfromthedonorgoatshowninc www sciencemag orgSCIENCEVOL30122AUGUST20031063 AMuleClonedfromFetalCellsbyNuclearTransfer Clonedmulefoal namedIdahoGem bornon4May2003 Photographtaken5May2003 copyrightPhilSchofield UniversityofIdaho 骡 NATURE VOL424 7AUGUST2003 Theclonedfoal namedPrometea withitsgeneticallyidenticalmothersevendaysafterbirth Thecellsusedforcloningwerederivedfromaskinbiopsyofthemare Theenucleatedoocyteswereobtainedbyinvitromaturationandremovalofthenucleusfromoocytesrecoveredfromhorseovariesfromanabattoir Afterembryoreconstructionbymicromanipulationandcellfusion thecleavedembryoswereculturedinvitrototheblastocyststage Twoofthederivedembryosweretransferredintothemaredonorofthecellline Asinglepregnancywasestablishedandwascarriedtotermwiththebirthofafemalefoalwhoisgeneticallyidenticaltohersurrogatemother a Snuppy thefirstcloneddog at67daysafterbirth right withthethree year oldmaleAfghanhound left whosesomaticskincellswereusedtoclonehim SnuppyisgeneticallyidenticaltothedonorAfghanhound b Snuppy left wasimplantedasanearlyembryointoasurrogatemother theyellowLabradorretrieverontheright andraisedbyher Dogsclonedfromadultsomaticcells Nature 2005Aug4 436 7051 641 Clonedferretsproducedbysomaticcellnucleartransfer DevBiol 2006May15 293 2 439 48 Epub2006Apr3 Fig 2 A Twoclonedsablecoat colorfemaleferretpups LibbyandLilly at7weeksofage producedbySCNTandETintoanalbinosurrogateJill B Lillywithher6newbornpups C Libbywithher10newbornpups 三 上海转基因研究中心获得的克隆动物 SP3179号波尔羊克隆羊 SP3179 CB 1 CB 2 CB 3 CB 4 CB 5 CB 6 CB 7 138号杂交一代波尔羊克隆羊 138 CO 2 CO 4 CO 6 CB 1O CO 12 CO 14 CO 16 CO 8 No 1 No 2 No 3 No 4 No 5 No 6 No 7 No 8 No 9 杂交二代波尔羊克隆羊 No 10 No 11 No 12 No 13 No 14 No 15 基因打靶体细胞克隆羊 四 影响核移植动物成功率的因素 卵母细胞去核率约70 移核成功率约90 融合率约80 重构胚发育成囊胚约30 移入受体母畜产生后代约30 核移植最终获得后代约3 8 核移植流程中各步骤的参数 一 核移植操作技术 二 供核细胞 三 供质细胞 卵母细胞 四 核移植胚胎的着床及着床后的发育 五 分娩与克隆动物的出生后护理 影响核移植动物成功率的因素 一 核移植操作技术对克隆效率的影响 1 去核 盲去 荧光下去核 化学去核 切割 移核 胞质 2 融合 电融合 仙台病毒 3 激活 4 NT胚胎的培养 5 NT胚胎移植 带下 二 供核细胞对克隆效率的影响因素 1 供核的分化程度对克隆效率的影响 1 胚胎细胞 胚胎分裂球 64 囊胚 2 胚胎干细胞 ES细胞 3 体细胞 颗粒细胞 成纤维细胞 1 供核的分化程度对克隆效率的影响 2 供核的类型对克隆效率的影响 三 供质细胞 供质卵母细胞对克隆效率的影响 2 细胞胞质受精卵胞质MII卵母细胞 InVivoandInvitro SerialPronuclearTransferIncreasestheDevelopmentalPotentialofInVitro MaturedOocytesinMouseCloning1 四 核移植胚胎的着床及着床后的发育 1 着床或妊娠率 受体的同步性 2 着床后的发育率 五 分娩与克隆动物的出生后护理 1 妊娠期 2 分娩与助产 3 刚出生克隆动物的护理 MammalEmbryoBio engineering 四 核移植技术的应用 第一个方面 在基础理论问题的研究第二个方面 在动物生产上的应用第三个方面 在生物医药上的应用 第一个方面 在基础理论问题的研究 如 核质之间的相互作用卵裂开始到着床前的发育 母源性基因调控胚胎细胞全性的调控到胚胎基因的调控 器官形成与组织发生的研究 组织发生的分子机制 基因表达的时空调的研究等 MammalEmbryoBio engineering 第二方面 在动物生产上的应用 1 挽救濒危动物 MammalEmbryoBio engineering 2 快速扩大优质种畜群 MammalEmbryoBio engineering 3 改造和培育动物新品种 转基因动物克隆动物生长快的动物 含人生长素基因的转基因小鼠 动物乳腺生物反应器 含人蛋白基因的转基因家畜 抵抗某些传染病的动物品种 如不感染疯牛病的转基因牛羊等 MammalEmbryoBio engineering 第三个方面 在生物医药上的应用 1 生产人用珍贵蛋白 家畜生物反应器 MammalEmbryoBio engineering 2 提供人类器官移植用组织器官 治疗性克隆 供人类器官移植用猪器官 克隆出可用于人体器官移植的猪 英国 Targeteddisruptionofthe s1 3galactosyltransferasegeneinclonepig NatureBiotech 2002 MammalEmbryoBio engineering 四 精子介导法 将外源DNA与精子一起孵育 精子可捕获外源DNA 并通过受精过程将外源DNA导入受精卵 此法不仅可免去复杂而昂贵的设备 且可省去不少繁杂的操作和条件准备 但该法有些结果不能重复 Lavitrano M etal 1989 SpermcellsasvectorsforintroducingforeignDNAintoeggs genetictransformationofmice Cell57 717 723 最引人注目的报道是意大利学者Lavitrano等在小鼠上进行的研究 他们将获得的小鼠附睾精子与线粒体或环状pSV2CAT质粒一起37 孵育30min后 再与成熟卵子进行体外授精 这样得到的胚胎在2 细胞期移植入受体鼠的输卵管内 在受体鼠产出的250只体外受精鼠有30 70 250 为阳性个体 实验还发现阳性个体中转入的基因可以稳定地整合入生殖细胞系 而且在转基因的后代个体的组织器官中 特别是在尾组织和肌肉组织中可检测到CAT基因的表达 Lavitrano M etal 1989 SpermcellsasvectorsforintroducingforeignDNAintoeggs genetictransformationofmice Cell57 717 723在Lavitrano的文章发表不久 Binster等根据Lavitrano的实验方案 用近10种基因结构