专题1基因工程 1.2基因工程的基本操作程序.ppt

专题1基因工程 1 2基因工程的基本操作程序 基因工程的基本操作程序 获取目的基因 构建表达载体 导入受体细胞 目的基因检测与鉴定 第一步 第二步 第三步 第四步 基因工程的基本操作流程图 一 目的基因的获取 一 从基因文库中获取目的基因 1 基因组文库 将含有某种生物不同基因的许多片段 导入受体菌的群体中储存 各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因 称为基因文库 受体菌包含了某种生物所有的基因 该受体菌群体称为这种生物的基因组文库 2 部分基因文库 受体菌包含了一种生物部分基因 该受体菌群体称为这种生物的部分基因文库 如cDNA文库 3 基因文库的构建 1 基因组文库的构建 提取某生物全部DNA 用适当限制酶切割 许多DNA片段 与载体连接导入受体菌群 该生物基因组文库 每个受体菌含有一段不同的DNA片段 2 cDNA文库的构建 mRNA反转录形成 mRNA 逆转录酶 杂交双链 核酸酶H 单链DNA DNA聚合酶 双链DNA 与载体连接导入受体菌群 该生物cDNA文库 非编码区 非编码区 编码区 RNA聚合酶结合位点 外显子 内含子 终止子 基因的结构 启动子 原核 真核 结构基因 外显子 内含子 转录 加工修饰 mRNA 二 利用PCR技术扩增目的基因 1 原理 PCR是聚合酶链式反应 polymerasechainreaction 它是利用DNA双链复制的原理 将基因的核苷酸序列不断的加以复制 使其数量呈指数方式增加 因为整个过程是在体外进行 所以又叫做体外DNA扩增技术 2 过程 高温变性 90 95 低温退火 55 60 中温延伸 70 75 双链DNA是在高温条件下解链为单链DNA的 因此整个过程不需要解旋酶 多次重复 3 特点 指数形式扩增 三 通过DNA合成仪直接合成目的基因 DNA合成仪 蛋白质的氨基酸顺序 mRAN核苷酸序列 基因DNA的核苷酸序列 目的基因 推测 推测 合成 当基因比较小 蛋白质的氨基酸序列可以测得或核苷酸序列已知时 可采用此种方法 二 基因表达载体的构建 用限制酶切割质粒使之出现一个切口 将目的基因插入切口处 让目的基因的黏性末端与切口上的黏性末端互补配对后 在连接酶的作用下连接形成重组DNA分子 即基因表达载体 质粒 目的基因 限制酶 质粒 目的基因 限制酶 一 构建目的 使目的基因在受体细胞中稳定存在 并且可遗传给下一代 同时 使目的基因能够表达和发挥作用 二 构建零件及其作用 1 目的基因 2 启动子RNA聚合酶识别和结合的一段特殊结构的DNA片段 位于基因的首端 RNA聚合酶与之结合才能驱动基因转录出mRNA 进而获得需要的蛋白质 3 终止子一段特殊结构的DNA片段 位于基因的尾端 作用是使转录在所需要的地方停止 4 标记基因鉴别受体细胞中是否含有目的基因 从而将含有目的基因的细胞筛选出来 三 将目的基因导入受体细胞 将目的基因导入受体细胞并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程称为转化 基因工程中常用的受体细胞有大肠杆菌 枯草杆菌 土壤农杆菌和动植物细胞等 导入受体细胞的方法主要是借鉴细菌或病毒侵染细胞的途径 且因受体细胞的不同而不同 1 农杆菌转化法 一 导入植物细胞 2 其他方法 见教材P12 生物技术资料卡 1 基因枪法 2 花粉管通道法 二 导入动物细胞 显微注射技术 含目的基因的表达载体 动物的受精卵 含目的基因的受精卵 早期胚胎 雌性动物输卵管或子宫 转基因动物 显微注射 分裂分化 移植 发育 问题 为什么将目的基因导入动物细胞常用的受体细胞是受精卵 三 导入微生物细胞 2 优点繁殖快 多为单细胞 遗传物质相对较少 操作简单 价格低廉 3 常用受体细胞大肠杆菌 E coli 1 过程 1 制备感受态细胞 用Ca2 CaCl2 处理细菌 使细菌易于接受外源DNA分子 2 重组DNA分子与感受态细胞混合孵育 完成转化 Ca2 处理法 四 目的基因的检测与鉴定 目的基因是否真正插入受体细胞的DNA中 是否能够在受体细胞中稳定遗传和正确表达 只有通过检测 鉴定才能得知 常用的检测手段主要从分子水平和个体水平进行 一 分子水平 1 检测转基因生物的染色体DNA上是否插入了目的基因 提取受体生物全部DNA 适当限制酶切割 DNA片段 用同位素标记的目的基因片段杂交 显出杂交带 表明目的基因已插入 分子杂交技术 2 检测目的基因是否转录出了mRNA 提取受体生物的mRNA 用同位素标记的目的基因片段杂交 显出杂交带 表明目的基因已转录出了mRNA 检测DNA利用的是DNA与DNA杂交 检测mRNA利用的是DNA与mRNA杂交 3 检测目的基因是否翻译出蛋白质 抗原 抗体杂交技术 提取受体生物的蛋白质 与相应抗体杂交 显出杂交带 表明目的基因已形成蛋白质产品 二 个体水平 例 用棉铃饲喂棉铃虫 如虫吃后不出现中毒症状 说明未摄入目的基因或摄入目的基因未表达 如虫吃后中毒死亡 则说明摄入了抗虫基因并得到表达 1 为什么要构建基因文库 直接从含有目的基因的生物体内提取不行吗 提示 构建基因文库是获取目的基因的方法之一 并不是惟一的方式 如果所需要的目的基因序列已知 就可以通过PCR方式从含有该基因的生物的DNA中 直接获得 也可以通过反转录 用PCR方式从mRNA中获得 不一定要构建基因文库 但如果所需要的目的基因的序列完全不知 或只知道目的基因序列的一段 或想从一种生物体内获得许多基因 或者想知道这种生物与另一种生物之间有多少基因不同 或者想知道一种生物在个体发育的不同阶段表达的基因有什么不同 或者想得到一种生物的全基因组序列 往往就需要构建基因文库 寻根问底 将目的基因直接导入受体细胞不是更简便吗 如果这么做 结果会怎样 提示 有人采用总DNA注射法进行遗传转化 即将一个生物中的总DNA提取出来 通过注射或花粉管通道法导入受体植物 没有进行表达载体的构建 这种方法针对性差 完全靠运气 也无法确定什么基因导入了受体植物 此法目前争议颇多 严格来讲不算基因工程 寻根问底 1 利用大肠杆菌可以生产出人的胰岛素 联系前面有关细胞器功能的知识 结合基因工程操作程序的基本思路 思考一下 若要生产人的糖蛋白 可以用大肠杆菌吗 有些蛋白质肽链上有共价结合的糖链 这些糖链是在内质网和高尔基复合体上加工完成的 内质网和高尔基复合体存在于真核细胞中 大肠杆菌不存在这两种细胞器 因此 在大肠杆菌中生产这种糖蛋白是不可能的 寻根问底 1 从小鼠中克隆出 珠蛋白基因的编码序列 cDNA 2 将cDNA前接上在大肠杆菌中可以适用的启动子 另外加上抗四环素的基因 构建成一个表达载体 3 将表达载体导入无四环素抗性的大肠杆菌中 然后在含有四环素的培养基上培养大肠杆菌 如果表达载体未进入大肠杆菌中 大肠杆菌会因不含有抗四环素基因而死掉 如果培养基上长出大肠杆菌菌落 则表明 珠蛋白基因已进入其中 4 培养进入了 珠蛋白基因的大肠杆菌 收集菌体 破碎后从中提取 珠蛋白 2 珠蛋白是动物血红蛋白的重要组成成分 当它的成分异常时 动物有可能患某种疾病 如镰刀形细胞贫血症 假如让你用基因工程的方法 使大肠杆菌生产出鼠的 珠蛋白 想一想 应如何进行设计 寻根问底 思考 作为基因工程表达载体 只需含有目的基因就可以完成任务吗 为什么 不可以 因为目的基因在表达载体中得到表达并发挥作用 还需要有其他控制元件 如启动子 终止子和标记基因等 必须构建上述元件的主要理由是 1 生物之间进行基因交流 只有使用受体生物自身基因的启动子才能比较有利于基因的表达 2 通过cDNA文库获得的目的基因没有启动子 只将编码序列导入受体生物中无法转录 3 目的基因是否导入受体生物中需要有筛选标记 4 为了增强目的基因的表达水平 往往还要增加一些其他调控元件 如增强子等 5 有时需要确定目的基因表达的产物存在于细胞的什么部位 往往要加上可以标识存在部位的基因 或做成目的基因与标识基因的融合基因 如绿色荧光蛋白基因等 3 根据农杆菌可将目的基因导入双子叶植物的机理 你能分析出不能导入单子叶植物的原因吗 若将一个抗病基因导入小麦中 理论上讲你应该怎样做 要选择合适的农杆菌菌株 因为不是所有的农杆菌菌株都可以侵染单子叶植物 要加趋化和诱导的物质 一般为乙酰丁香酮等 目的是使农杆菌向植物组织的受伤部位靠拢 趋化性 和激活农杆菌的Vir区 诱导 的基因 使T DNA转移并插入到染色体DNA上 寻根问底 1 为了培育节水高产品种 科学家将大麦中与抗旱节水有关的基因导入小麦 得到转基因小麦 其水分利用率提高了20 这项技术的遗传学原理是 A 基因重组B 基因突变C 基因复制D 基因分离 巩固练习 A 2 利用苏云金芽孢杆菌的抗虫基因培育的抗虫棉是否成功 最好检测 A 是否有抗生素产生B 是否有目的基因表达C 是否有抗虫的性状出现D 是否能分离到目的基因 巩固练习 C 3 水母发光蛋白由236个氨基酸构成 其中天冬氨酸 甘氨酸和丝氨酸构成发光环 现已将这种蛋白质的基因作为生物转基因的标记 在转基因技术中 这种蛋白质的作用是 A 促使目的基因导入受体细胞B 促使目的基因在受体细胞内复制C 使目的基因容易被检测出来D 使目的基因容易成功表达 巩固练习 C 4 根据mRNA的信息推出获取目的基因的方法是 A 用DNA探针测出目的基因B 用mRNA探针测出目的基因C 用mRNA反转录形成目的基因D 用PCR技术扩增mRNA 巩固练习 C 5 PCR技术扩增DNA 需要的条件是 目的基因 引物 四种脱氧核苷酸 DNA聚合酶等 mRNA 核糖体A B C D 巩固练习 A 6 获取目的基因的方法有多种 下列不属于目的基因获取方法的是 A 从基因组文库中获取B 从cDNA文库中获取C 从含目的基因生物细胞中获取D 利用PCR技术获取 巩固练习 D 7 下列高科技成果中 根据基因重组原理进行的是 A 我国科学家袁隆平利用杂交技术培育出超级水稻 B 我国科学家将苏云金杆菌的某些基因转移到棉花体内 培育出抗虫棉 C 我国科学家通过返回式卫星搭载种子培育出太空椒 D 我国科学家通过体细胞克隆技术培育出克隆牛 巩固练习 AB 8 有关基因工程的叙述正确的是 A 限制性内切酶只在获得目的基因时才使用B DNA连接酶可以切断磷酸二酯键C 质粒都可以做载体D 基因工程都能定向改变生物的性状 巩固练习 D 9 科学家将控制某药物蛋白合成的基因转移到白色来亨鸡胚胎细胞的DNA中 发育后的雌鸡就能产出含该药物蛋白的鸡蛋 在每一只鸡蛋的蛋清中都含有大量的药