色谱分析部分-河北医科大学分析化学教研室+.ppt

1 色谱分析部分 河北医科大学分析化学教研室樊淑彦 2 第一章色谱分析法概论 简介色谱分析法简称色谱法是一种物理或物理化学分离分析方法 历史上1948年瑞典科学家Tiselins因电泳和吸附分析的研究而获诺贝尔化学奖 1952年英国的马丁 Martin 和辛格 Synge 因发展分配色谱而获诺贝尔化学奖 3 简介 色谱法创始于20世纪初 早在1903年由俄国植物学家茨维特分离植物色素时采用 他在研究植物叶的色素成分时 将植物叶子的萃取物倒入填有碳酸钙的直立玻璃管内 然后加入石油醚使其自由流下 结果色素中各组分互相分离形成各种不同颜色的谱带 这种方法因此得名为色谱法 以后此法逐渐应用于无色物质的分离 色谱 二字虽已失去原来的含义 但仍被人们沿用至今 4 固定相 色谱过程 流动相 被分离组分 5 第一节色谱法的分类和发展 气体固体气 固色谱气体液体气 液色谱 从不同角度 可将色谱法分类如下 1 按两相状态分类 气相色谱 流动相 固定相 6 第一节色谱法的分类和发展 2 按分离机理分类利用组分在吸附剂 固定相 上的吸附能力强弱不同而得以分离的方法 称为吸附色谱法 利用组分在固定液 固定相 中溶解度不同而达到分离的方法称为分配色谱法 利用组分在离子交换剂 固定相 上的亲和力大小不同而达到分离的方法 称为离子交换色谱法 7 第一节色谱法的分类和发展 利用某些凝胶对不同组分因分子大小不同而阻滞作用不同的差异 而进行分离的方法称为凝胶排阻色谱法 利用不同组分与固定相 固定化分子 的高专属性亲和力进行分离的技术称为亲和色谱法 常用于蛋白质的分离 根据组分的电泳速度差异而达到分离的方法 称为毛细管电泳法 8 第一节色谱法的分类和发展 3 按操作形式分类固定相装于柱内的色谱法 称为柱色谱 固定相呈平板状的色谱 称为平面色谱 它又可分为薄层色谱 薄膜色谱和纸色谱 在毛细管内进行分离的过程 称为毛细管电泳法和电色谱法 4 按照展开程序分类按照展开程序的不同 可将色谱法分为洗脱法 顶替法 和迎头法 9 第一节色谱法的分类和发展 洗脱法也称冲洗法 工作时 首先将样品加到色谱柱头上 然后用吸附或溶解能力比试样组分弱得多的气体或液体作冲洗剂 由于各组分在固定相上的吸附或溶解能力不同 被冲洗剂带出的先后次序也不同 从而使组分彼此分离 这种方法能使样品的各组分获得良好的分离 色谱峰清晰 此外 除去冲洗剂后 可获得纯度较高的物质 目前 这种方法是色谱法中最常用的一种方法 10 第一节色谱法的分类和发展 A B 洗脱法流出曲线如下图 11 第一节色谱法的分类和发展 顶替法是将样品加到色谱柱头后 在惰性流动相中加入对固定相的吸附或溶解能力比所有试样组分强的物质为顶替剂 或直接用顶替剂作流动相 通过色谱柱 将各组分按吸附或溶解能力的强弱顺序 依次顶替出固定相 很明显 吸附或溶解能力最弱的组分最先流出 最强的最后流出 12 第一节色谱法的分类和发展 此法适于制备纯物质或浓缩分离某一组分 其缺点是经一次使用后 柱子就被样品或顶替剂饱和 必须更换柱子或除去被柱子吸附的物质后 才能再使用 13 第一节色谱法的分类和发展 顶替法的流出曲线如下图 A B 14 第一节色谱法的分类和发展 迎头法是将试样混合物连续通过色谱柱 吸附或溶解能力最弱的组分首先以纯物质的状态流出 其次则以第一组分和吸附或溶解能力较弱的第二组分混合物 以此类推 15 第一节色谱法的分类和发展 该法在分离多组分混合物时 除第一组分外 其余均非纯态 因此仅适用于从含有微量杂质的混合物中切割出一个高纯组分 组分A 而不适用于对混合物进行分离 A A B 16 第一节色谱法的分类和发展 色谱法的特点优点 三高 一快 一广 高选择性 可将性质相似的组分分开高效能 反复多次利用组分性质的差异产生很好分离效果高灵敏度 10 11 10 13g 适于痕量分析分析速度快 几 几十分钟完成分离一次可以测多种样品应用范围广 气体 液体 固体物质化学衍生化再色谱分离 分析 17 第一节色谱法的分类和发展 缺点 对未知物分析的定性专属性差需要与其他分析方法联用 GC MS LC MS 18 第一节色谱法的分类和发展 色谱法的历史1903年由俄国植物学家Tsweet创立植物色素分离到现在已成为一种重要的分离 分析技术 分离混合物各组分并加以分析 19 第一节色谱法的分类和发展 色谱法的发展30 40年代TLC 纸色谱40年代出现分配色谱50年代出现GC使色谱具备分离和在线分析功能60年代GC MS 20 第一节色谱法的分类和发展 70年代出现HPLC 使色谱分析范围进一步扩大80年代发展了超临界流体色谱90年代 兼有毛细管电泳和高效液相色谱优点的毛细管电色谱受到广泛的重视 21 第一节色谱法的分类和发展 色谱法发展趋势 新型固定相和检测器的研制色谱新方法的研究联用仪器 GC MS HPLC MS等色谱专家系统智能化发展 22 第二节色谱过程和基本原理 一 色谱过程指被分离组分在两相中的 分配 平衡过程以吸附色谱为例见图示吸附 解吸 再吸附 再解吸 反复多次洗脱 被测组分分配系数不同 差速迁移 分离 23 第二节色谱过程和基本原理 分配系数的微小差异 吸附能力的微小差异微小差异积累 较大差异 吸附能力弱的组分先流出 吸附能力强的组分后流出 24 第二节色谱过程和基本原理 色谱分离原理色谱分离基于各组分在两相之间平衡分配的差异 平衡分配可以用分配系数和分配比来衡量 25 第二节色谱过程和基本原理 色谱分离特点不同组分通过色谱柱时的迁移速度不等 提供了分离的可能性各组分沿柱子扩散分布 峰宽 不利于不同组分分离 26 第二节色谱过程和基本原理 二 色谱流出曲线和有关概念 一 色谱流出曲线和色谱峰1 色谱峰由检测器输出的电信号强度对时间作图 所得曲线称为色谱流出曲线 曲线上突起部分就是色谱峰 如果进样量很小 浓度很低 在吸附等温线 气固吸附色谱 或分配等温线 气液分配色谱 的线性范围内 则色谱峰是对称的 27 图示 28 第二节色谱过程和基本原理 色谱峰 正常色谱峰不正常色谱峰 色谱峰分为 正常色谱峰 曲线有最高点 以此点横坐标为中心 曲线对称向两侧快速 单调下滑 不正常色谱峰分为 前沿峰 拖尾峰 29 第二节色谱过程和基本原理 不对称因子 30 第二节色谱过程和基本原理 前沿峰 前沿平缓 后沿陡峭 拖尾峰 前沿陡峭 后沿平缓 31 第二节色谱过程和基本原理 2 基线 在实验操作条件下 色谱柱后没有样品组分流出时的流出曲线称为基线 稳定的基线应该是一条水平直线 3 噪音 仪器本身所固有的 以噪音带表示 仪器越好 噪音越小 4 漂移 基线向某个方向稳定移动 仪器未稳定造成 5 峰高 色谱峰顶点与基线之间的垂直距离 以 h 表示 32 第二节色谱过程和基本原理 色谱流出曲线色谱流出曲线和色谱峰基线 a 峰高 h 信号 进样 空气峰 色谱峰 h a 33 第二节色谱过程和基本原理 二 保留值1 死时间 deadtimet0 不被固定相吸附或溶解的物质进入色谱柱时 从进样到出现峰极大值所需的时间称为死时间 它正比于色谱柱的空隙体积 因为这种物质不被固定相吸附或溶解 故其流动速度将与流动相流动速度相近 测定流动相平均线速 时 可用柱长L与t0的比值计算 即 L t0 34 第二节色谱过程和基本原理 2 保留时间 retentiontimetR 试样从进样到柱后出现浓度极大点时所经过的时间 称为保留时间 35 第二节色谱过程和基本原理 3 调整保留时间 adjustedretentiontimetR 某组分的保留时间扣除死时间后 称为该组分的调整保留时间 即tR tR t0由于组分在色谱柱中的保留时间tR包含了组分随流动相通过柱子所须的时间和组分在固定相中滞留所需的时间 所以tR实际上是组分在固定相中保留的总时间 保留时间是色谱法定性的基本依据 但同一组分的保留时间常受到流动相流速的影响 因此色谱工作者有时用保留体积来表示保留值 36 第二节色谱过程和基本原理 4 死体积 deadvolumeV0 指色谱柱在填充后 柱管内固定相颗粒间所剩留的空间 包括色谱仪中管路和连接头间的空间以及检测器的空间的总和 V0 t0Fc 37 第二节色谱过程和基本原理 5 保留体积 retentionvolume VR 指从进样开始到被测组分在柱后出现浓度极大点时所通过的流动相的体积 保留时间与保留体积关系 VR tRFc6 调整保留体积 adjustedretentionvolume VR 某组分的保留体积扣除死体积后的体积 称为该组分的调整保留体积 VR VR V0 tR Fc 38 第二节色谱过程和基本原理 7 相对保留值 relativeretention r2 1 某组分2的调整保留值与组分1的调整保留值之比 称为相对保留值 r2 1 tR2 tR1 VR2 VR1 由于相对保留值只与柱温及固定相性质有关 而与柱径 柱长 填充情况及流动相流速无关 因此 它在色谱法中 特别是在气相色谱法中 广泛用作定性的依据 39 第二节色谱过程和基本原理 在定性分析中 通常固定一个色谱峰作为标准 s 然后再求其它峰 i 对这个峰的相对保留值 此时可用符号 表示 即 tR i tR s 式中tR i 为后出峰的调整保留时间 所以 总是大于1的 相对保留值往往可作为衡量固定相选择性的指标 又称选择因子 40 第二节色谱过程和基本原理 8 保留指数 retentionindex I 在GC中 把组分的保留行为换算成相当于正构烷烃的保留行为 即以正构烷烃系列作为组分相对保留值的标准 用两个保留时间紧邻待测组分的基准物质来标定组分 这个相对值称为保留指数 41 第二节色谱过程和基本原理 保留指数又称为柯瓦 Kov ts 指数 它表示物质在固定液上的保留行为 是目前使用最广泛并被国际上公认的定性指标 它具有重现性好 标准统一及温度系数小等优点 保留指数也是一种相对保留值 它是把正构烷烃中某两个组分的调整保留值的对数作为相对的尺度 并假定正构烷烃的保留指数为n 100 被测物的保留指数值可用内插法计算 42 43 三 区域宽度 表示色谱峰区域宽度通常有三种方法 1 标准偏差 standarddeviation 即0 607倍峰高处色谱峰宽的一半 2 半峰宽 peakwidthathalfheight W1 2 即峰高一半处对应的峰宽 它与标准偏差的关系为W1 2 2 354 3 峰宽 peakwidth W 即色谱峰两侧拐点上的切线在基线上截距间的距离 它与标准偏差 的关系是W 4 44 注除了用于衡量柱效 还可以计算峰面积 45 第二节色谱过程和基本原理 四 分离度 resolution R 是一个综合性指标 分离度是既能反映柱效率又能反映选择性的指标 称总分离效能指标 分离度又叫分辨率 它定义为相邻两组分色谱峰保留值之差与两组分色谱峰峰宽总和之半的比值 即R 2 tR2 tR1 W1 W2R值越大 表明相邻两组分分离越好 一般说 当R 1时 两峰有部分重叠 当R 1时 分离程度可达98 当R 1 5时 分离程度可达99 7 通常用R 1 5作为相邻两组分已完全分离的标志 46 第二节色谱过程和基本原理 从色谱流出曲线中 可得许多重要信息 i 根据色谱峰的个数 可以判断样品中所含组分的最少个数 ii 根据色谱峰的保留值 可以进行定性分析 iii 根据色谱峰的面积或峰高 可以进行定量分析 iv 色谱峰的区域宽度 是评价色谱柱分离效能的依据 v 色谱峰两峰间的距离 是评价固定相 或流动相 选择是否合适的依据 47 第二节色谱过程和基本原理 一 分配系数和容量因子分配系数 distributioncoefficient K 它是指在一定温度和压力下 组分在固定相和流动相之间分配达平衡时的浓度之比 即K 溶质在固定相中的浓度 溶质在流动相中的浓度 Cs Cm 48 第二节色谱过程和基本原理 2 容量因子 capacityfactor k 容量因子又称分配比 它是指在一定温度和压力下 组分在两相间分配达平衡时 分配在固定相和流动相中的质量比 即k 组分在固定相中的质量 组分在流动相中的质量 ms mmk ms mm CsVS CmVm 49 第二节色谱过程和基本原理 3 分配系数K与分配比k的关系tR t0 1 KVs Vm k KVs Vm 50 第二节色谱过程和基本原理 4 分配系数K及分配比k与选择因子 的关系对A B两组分的选择因子 用下式表示 t R B t R A k A k B K A K B 通过选择因子 把实验测量值k与热力学性质的分配系数K直接联系起来 对固定相的选择具有实际意义 如果两组分的K或k值相等 则 1 两个组分的色谱峰必将重合 说明分不开 两组分的K或k值相差越大 则分离得越好 因此两组分具有不同的分配系数是色谱分离的先决条件 51 第二节色谱过程和基本原理 下图是A B两组分沿色谱柱移动时 不同位置处的浓度轮廓 浓度 沿柱移动距离L A B A B KA KB 溶质A和B在沿柱移动时不同位置处的浓度轮廓 52 第二节色谱过程和基本原理 若要使A B组分完全分离 必须满足以下三点 第一 两组分的分配系数必须有差异 第二 区域扩宽的速率应小于区域分离的速度 第三 在保证快速分离的前提下 提供足够长的色谱柱 53 第三节色谱基本类型及其分离机制 根据色谱过程的作用机制 色谱方法分为 一分配色谱法二吸附色谱法三离子交换色谱法四空间排阻色谱法 54 第三节色谱基本类型及其分离机制 一 分配色谱法基本要求 固定相 机械吸附在惰性载体上的液体流动相 必须与固定相互不相溶载体 惰性 性质稳定 不与固定相和流动相发生化学反应分离机制见图示 55 第三节色谱基本类型及其分离机制 分离机制利用组分在流动相和固定相间溶解度差别实现分离 56 第三节色谱基本类型及其分离机制 狭义分配系数 m m s s m s V X V X C C K 注 K与组分的性质 流动相的性质 固定相的性质以及柱温有关 57 第三节色谱基本类型及其分离机制 洗脱顺序 正相色谱 极性强的组分在固定相保留较强 保留时间长 后出柱 反相色谱 极性强的组分在固定相保留较弱 保留时间短 先出柱 58 第三节色谱基本类型及其分离机制 二 吸附色谱法基本要求 固定相 吸附剂 硅胶或AL2O3 具表面活性吸附中心分离机制 见图示 59 第三节色谱基本类型及其分离机制 分离机制 各组分与流动相分子争夺吸附剂表面活性中心利用吸附剂对不同组分的吸附能力差异而实现分离 吸附 解吸 再吸附 再解吸 无数次洗脱 分开 60 第三节色谱基本类型及其分离机制 吸附平衡Xm nYa Xa nYm m m a a n a m n m a a V X S X Y X Y X K 注 Ka与组分的性质 吸附剂的活性 流动相的性质及温度有关 吸附系数 61 第三节色谱基本类型及其分离机制 溶剂的洗脱能力用Snyder提出的溶剂强度来定量 0值越大 固定相对溶剂的吸附能力越强 洗脱能力越强 62 第三节色谱基本类型及其分离机制 吸附规律 1 饱和碳氢化合物为非极性化合物 一般不被吸收 2 基本母核相同的化合物 分子中引入的取代基极性越强 整个分子的极性越强 吸附能力越强 3 不饱和化合物比饱和化合物的吸附能力强 双键越多 吸附力越强 4 分子中取代基的空间排列也有影响 洗脱顺序 在色谱住一定 Sa与Vm一定 时 Ka大的组分在吸附剂上保留强 后被洗脱 Ka小的组分在吸附剂上保留弱 先被洗脱 63 第三节色谱基本类型及其分离机制 三 离子交换色谱法1 基本要求 固定相 离子交换树脂流动相 水为溶剂的缓冲溶液被分离组分 离子型的有机物或无机物2 分离机制见图示 64 第三节色谱基本类型及其分离机制 分离机制 依据被测组分与离子交换剂交换能力 亲和力 不同而实现分离 65 第三节色谱基本类型及其分离机制 阳离子交换树脂RSO3 H X RSO3 X H 固定离子可交换离子待测离子选择性系数 m S S m S m S S H H RSO X X RSO X H RSO H X RSO K 3 3 3 3 注 Ks与离子的电荷数 水合离子半径 流动相性质 离子交换树脂性质以及温度有关 66 第三节色谱基本类型及其分离机制 由以上经验可预见一些离子亲和顺序 1 阳离子 Fe3 Al3 Ba2 Pb2 Sr2 Ca2 Ni2 Cd2 Cu2 Co2 Mg2 Zn2 Mn2 Ag Cs Rb K NH4 Na H Li 2 阴离子 柠檬酸根 PO43 SO42 I NO3 SCN NO2 Cl HCO3 CH2COO OH F 67 第三节色谱基本类型及其分离机制 3 离子交换树脂的性能 1 交联度 degreeofcross linking 表示离子交换树脂中交联剂的含量 2 交换容量 exchangecapacity 是指每克干树脂中真正参加交换反应的基团数 交联度与树脂孔隙大小有关 交联度大 形成网状结构紧密 网眼小 选择性高 交联度小 形成网状结构疏松 网眼大 选择性低 68 第三节色谱基本类型及其分离机制 选择树脂的一般规律 被分离的物质 如果是无机阳离子或有机碱时 选阳离子交换树脂 如果是无机阴离子或有机酸时 选阴离子交换树脂 环境的酸碱性 在酸性 中性或碱性环境中 可以使用强酸和强碱性离子交换树脂 弱酸性离子交换树脂宜在碱性环境中使用 弱碱性离子交换树脂宜在酸性环境中使用 选择性系数 选择性系数大的离子 选用弱酸性或弱碱性离子交换树脂 若用强酸或强碱性离子交换树脂会造成洗脱和再生的困难 选择性系数小的离子 选用强酸性或强碱性离子交换树脂 离子交换反应 中性盐的分解反应 应选强酸或弱碱性离子交换树脂 69 第三节色谱基本类型及其分离机制 H 型或OH 型离子交换树脂 因会交换出H 或OH 而改变溶液的pH值 应根据是否会影响交换反应或再生反应的具体情况选择 交联度 分子量较高的物质 选用交联度较低的树脂 分离性质相似的小分子物质选用交联度高的树脂 粒度 粒度小的树脂表面积大 效率高 但流速慢 应根据具体的需要选择 制备无离子水 树脂制多为16 60目 色谱分离用树脂多为200 400目 球形树脂一般要比无定型的好 交换容量 一般应选择交换容量大的数脂为好 交换容量是指每克树脂能参加反应的活性基团数 树脂内所含活性基团越多 交换容量就大 树脂进行交换反应的能力就强 70 第三节色谱基本类型及其分离机制 四 空间排阻色谱法基本要求 固定相 多孔性凝胶流动相 水 凝胶过滤色谱流动相 有机溶剂 凝胶渗透色谱分离机制见图示 71 第三节色谱基本类型及其分离机制 分离机制 利用被测组分分子大小不同 在固定相上选择性渗透实现分离 72 第三节色谱基本类型及其分离机制 渗透系数 m S P X X K 注 Kp仅取决于待测分子尺寸和凝胶孔径大小 与流动相的性质无关 Xs 0 则kp 0 不能进入凝胶的任何孔隙 Xs Xm 则kp 1 能进入凝胶的任何孔隙0 Kp 1 能进入部分孔隙 73 第三节色谱基本类型及其分离机制 保留体积与渗透系数的关系 VR Vm 1 KPVS Vm VR V0 kPVS注 Vm为色谱柱内凝胶的粒间体积 VS为凝胶孔隙的总体积 分子量大的组分 其渗透系数小 保留体积小 先出柱 74 第三节色谱基本类型及其分离机制 凝胶有葡聚糖和聚丙烯酰胺凝胶凝胶是含大量液体 一般是水 的柔软而富于弹性的物质 是一种经过交联而具有立体结构的多聚体 吸水量大于7 5g g的凝胶称为软胶 吸水量小于7 5g g的凝胶称为硬胶 交联度大 孔隙小 吸水少 膨胀少 适用于小分子量物质的分离 交联度小 孔隙大 吸水多 膨胀多 适用于大分子量物质的分离 75 第三节色谱基本类型及其分离机制 结论 四种色谱的分离机制各不相同 分别形成吸附平衡 分配平衡 离子交换平衡和渗透平衡K分别为吸附系数 狭义分配系数 选择性系数和渗透系数除了凝胶色谱法中的K仅与待测分子大小尺寸 凝胶孔径大小有关外 其他三种K值都受组分的性质 流动相的性质 固定相的性质以及柱温的影响 76 第四节色谱法基本理论 塔板理论和速率理论均以色谱过程中分配系数恒定为前提 故称为线性色谱理论 一 塔板理论把色谱柱比作一个精馏塔 沿用精馏塔中塔板的概念来描述组分在两相间的分配行为 同时引入理论塔板数作为衡量柱效率的指标 即色谱柱是由一系列连续的 相等的水平塔板组成 每一块塔板的高度用H表示 称为塔板高度 简称板高 77 第四节色谱法基本理论 塔板理论假设 1 在柱内一小段长度H内 组分可以在两相间迅速达到平衡 这一小段柱长称为理论塔板高度H 2 流动相进入色谱柱不是连续进行的 而是间歇式 每次进气为一个塔板体积 Vm 3 所有组分开始时存在于第0号塔板上 而且试样沿轴 纵 向扩散可忽略 4 分配系数在所有塔板上是常数 与组分在某一塔板上的量无关 78 色谱峰的二项式分布 N较少 逆流分布 萃取法 利用物质在互不相溶两相中溶解度的不同 79 80 图示 81 色谱峰的正态分布 N 50次 近似对称分布 82 第四节色谱法基本理论 简单地认为 在每一块塔板上 溶质在两相间很快达到分配平衡 然后随着流动相按一个一个塔板的方式向前移动 对于一根长为L的色谱柱 溶质平衡的次数应为 n L Hn称为理论塔板数 与精馏塔一样 色谱柱的柱效随理论塔板数n的增加而增加 随板高H的增大而减小 理论塔板高度H 为使组分在柱内两相间达到一次分配平衡所需要的柱长理论塔板数N 组分流过色谱柱时 在两相间进行平衡分配的总次数 83 第四节色谱法基本理论 塔板理论说明 第一 当溶质在柱中的平衡次数 即理论塔板数n大于50时 可得到基本对称的峰形曲线 在色谱柱中 n值一般很大 如气相色谱柱的n约为103 106 因而这时的流出曲线可趋近于正态分布曲线 84 第四节色谱法基本理论 第二 当样品进入色谱柱后 只要各组分在两相间的分配系数有微小差异 经过反复多次的分配平衡后 仍可获得良好的分离 第三 n与半峰宽及峰底宽的关系式为 n 5 54 tR W1 2 2 16 tR W 2式中tR与W1 2 W 应采用同一单位 时间或距离 从公式可以看出 在tR一定时 如果色谱峰很窄 则说明n越大 H越小 柱效能越高 85 第四节色谱法基本理论 在实际工作中 由公式n L H和n 5 54 tR W1 2 2 16 tR W 2计算出来的的n和H值有时并不能充分地反映色谱柱的分离效能 因为采用tR计算时 没有扣除死时间t0 所以常用有效塔板数n有效表示柱效 n有效 5 54 tR W1 2 2 16 tR W 2有效板高 H有效 L n有效因为在相同的色谱条件下 对不同的物质计算的塔板数不一样 因此 在说明柱效时 除注明色谱条件外 还应指出用什么物质进行测量 86 第四节色谱法基本理论 例1已知某组分峰的峰底宽为40s 保留时间为400s 计算此色谱柱的理论塔板数 解n 16 tR W 2 16 400 40 2 1600块例2在柱长2m 5 阿皮松柱 柱温100 记录纸速为2 0cm min的实验条件下 测定苯的保留时间为1 50min 半峰宽为0 10cm 求理论塔板高度和每米的理论塔板数 解 n 5 54 tR w1 2 2 5 54 1 50 0 10 2 0 2 2 4 103H 2000 2 4 103 0 83 mm 每米理论塔板数为2 4 103 2 1 2 103 m 1 87 第四节色谱法基本理论 塔板理论是一种半经验性理论 它用热力学的观点定量说明了溶质在色谱柱中移动的速率 解释了流出曲线的形状 并提出了计算和评价柱效高低的参数 但是 色谱过程不仅受热力学因素的影响 而且还与分子的扩散 传质等动力学因素有关 因此塔板理论只能定性地给出板高的概念 却不能解释板高受哪些因素影响 也不能说明为什么在不同的流速下 可以测得不同的理论塔板数 因而限制了它的应用 88 塔板理论优缺点 成功处 解释了色谱流出曲线的形状和浓度极大值对应的tR阐明了保留值与K的关系评价柱效 n 存在问题 1 做出了四个与实际不相符的假设忽略了组分在两相中传质和扩散的动力学过程2 只定性给出塔板高度的概念 却无法解释板高的影响因素3 排除了一个重要参数 流动相的线速度u 因而无法解释柱效与流速关系 更无法提出降低板高的途径 89 第四节色谱法基本理论 二 速率理论1956年荷兰学者vanDeemter 范第姆特 等在研究气液色谱时 提出了色谱过程动力学理论 速率理论 他们吸收了塔板理论中板高的概念 并充分考虑了组分在两相间的扩散和传质过程 从而在动力学基础上较好地解释了影响板高的各种因素 该理论模型对气相 液相色谱都适用 VanDeemter方程的数学简化式为H A B u Cu式中u为流动相的线速度 A B C 为常数 分别代表涡流扩散系数 分子扩散项系数 传质阻力项系数 90 第四节色谱法基本理论 1 涡流扩散项A在填充色谱柱中 当组分随流动相向柱出口迁移时 流动相由于受到固定相颗粒障碍 不断改变流动方向 使组分分子在前进中形成紊乱的类似涡流的流动 故称涡流扩散 由于填充物颗粒大小的不同及填充物的不均匀性 使组分在色谱柱中路径长短不一 因而同时进色谱柱的相同组分到达柱口时间并不一致 引起了色谱峰的变宽 色谱峰变宽的程度由下式决定 A 2 dp 91 第四节色谱法基本理论 上式表明 A与填充物的平均直径dp的大小和填充不规则因子 有关 与流动相的性质 线速度和组分性质无关 为了减少涡流扩散 提高柱效 使用细而均匀的颗粒 并且填充均匀是十分必要的 对于空心毛细管 不存在涡流扩散 因此A 0 92 第四节色谱法基本理论 产生原因 载气携样品进柱 遇到来自固定相颗粒的阻力 路径不同 涡流扩散影响因素 固体颗粒越小 填充越实 A项越小 注 颗粒太小 柱压过高且不易填充均匀填充柱 60 100目空心毛细管柱 0 1 0 5mm A 0 n理较高 93 图示 94 第四节色谱法基本理论 2 分子扩散项B u 纵向扩散项 纵向分子扩散是由浓度梯度造成的 组分从柱入口加入 其浓度分布的构型呈 塞子 状 它随着流动相向前推进 由于存在浓度梯度 塞子 必然自发的向前和向后扩散 造成谱带展宽 分子扩散项系数为B 2 Dg 95 第四节色谱法基本理论 是填充柱内流动相扩散路径弯曲的因素 也称弯曲因子 它反映了固定相颗粒的几何形状对自由分子扩散的阻碍情况 Dg为组分在流动相中扩散系数 cm3 s 1 分子扩散项与组分在流动相中扩散系数Dg成正比 Dg与流动相及组分性质有关 a 相对分子质量大的组分Dg小 Dg反比于流动相相对分子质量的平方根 所以采用相对分子质量较大的流动相 可使B项降低 b Dg随柱温增高而增加 但反比于柱压 96 第四节色谱法基本理论 另外纵向扩散与组分在色谱柱内停留时间有关 流动相流速小 组分停留时间长 纵向扩散就大 因此为降低纵向扩散影响 要加大流动相速度 对于液相色谱 组分在流动相中纵向扩散可以忽略 97 第四节色谱法基本理论 纵向分子扩散使峰展宽 a 柱内谱带构形 b 相应的响应信号 a b 98 第四节色谱法基本理论 产生原因 峰在固定相中被流动相推动向前 展开 两边浓度差 影响因素 注 为降低纵向扩散 宜选用分子量较大的载气 控制较高线速度和较低的柱温 选择载气原则 兼顾分析时间和减小纵向扩散u较小时 选M较大的N2气 粘度大 u较大时 选M较小的H2气 He气 粘度小 99 第四节色谱法基本理论 3 传质阻力项Cu由于气相色谱以气体为流动相 液相色谱以液体为流动相 它们的传质过程不完全相同 产生原因 样品在气液两相分配 样品未及溶解就被带走 从而造成峰扩张 100 第四节色谱法基本理论 1 气液色谱传质阻力系数C包括气相传质阻力系数Cg和液相传质阻力系数C1两项 即C Cg C1气相传质过程是指试样组分从气相移动到固定相表面的过程 这一过程中试样组分将在两相间进行质量交换 即进行浓度分配 有的分子还来不及进入两相界面 就被气相带走 101 第四节色谱法基本理论 有的则进入两相界面又来不及返回气相 这样使得试样在两相界面上不能瞬间达到分配平衡 引起滞后现象 从而使色谱峰变宽 对于填充柱 气相传质阻力系数Cg为 Cg 0 01k2 1 k 2 dp Dg式中k为容量因子 由上式看出 气相传质阻力与填充物粒度dp的平方成正比 与组分在载气流中的扩散系数Dg成反比 因此 采用粒度小的填充物和相对分子质量小的气体 如氢气 做载气 可使Cg减小 提高柱效 102 第四节色谱法基本理论 液相传质过程是指试样组分从固定相的气 液界面移动到液相内部 并发生质量交换 达到分配平衡 然后又返回气 液界面的传质过程 这个过程也需要一定的时间 此时 气相中组分的其它分子仍随载气不断向柱口运动 于是造成峰形扩张 液相传质阻力系数C1为 C1 2 3 k 1 k 2 df2 Dl 103 第四节色谱法基本理论 2 液液分配色谱传质阻力系数 C 包含流动相传质阻力系数 Cm 和固定相传质阻力系数 Cs 即C Cm Cs 104 第四节色谱法基本理论 其中Cm又包含流动的流动相中的传质阻力和滞留的流动相中的传质阻力