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实验一植物基因组DNA的提取 一 实验目的 1 了解真核生物基因组DNA提取的一般原理 2 掌握DNA提取的方法和步骤 二 一般原理提取DNA的一般原理 是将分散好的真核生物组织细胞在含SDS和蛋白酶K的溶液中消化分解蛋白质 再用酚 异戊醇抽提的方法去除蛋白质 得到的DNA经乙醇沉淀或透析等方法进一步纯化 三 材料玉米叶片四 设备移液器 冷冻高速离心机 台式高速离心机 水浴锅 陶瓷研钵 1 5mL离心管 五 试剂提取缓冲液 100mmol LTris Cl 20mmol LEDTA 500mmol LNaCl 1 5 SDS 氯仿 异戊醇 乙醇 80 4 16 TE缓冲液 10mmol LTris Cl pH8 0 1mmol LEDTA pH8 0 其他试剂 液氮 异丙醇 无水乙醇 70 乙醇 3mol LNaAc pH5 2 六 操作步骤在7ml离心管中加入2ml提取缓冲液 60 水浴预热 取玉米幼叶0 5g 在研钵中加液氮磨成粉状后立即倒入预热的离心管中 摇动混匀 60 水浴保温30 60min 时间长 DNA产量高 不时摇动 加入2ml氯仿 异戊醇 乙醇 80 4 16 溶液 颠倒混匀 需带手套 防止损伤皮肤 室温下静置5 10min 使水相和有机相分层 室温下5000rpm离心5min 小心移取上清液至另一7ml离心管 加入等体积异丙醇 混匀 室温下放置片刻即出现絮状DNA沉淀 用钩状玻璃棒捞出DNA絮团 在干净的吸水纸上吸干 放入含200 lTE的离心管中 若絮团太少 亦可直接室温下5000rpm离心5min 去除上清液 再加入200 lTE溶解沉淀 加入1 lRNaseA 10 g l 37 水浴保温10min 除去RNA RNA对DNA的操作 分析一般无影响 可省略该步骤 加入1 10体积 约20 l 的3mol LNaAc及二倍体积 约400 l 预冷的无水乙醇 混匀 20 放置20min左右 室温下5000rpm离心5min 去上清 用1ml70 乙醇漂洗沉淀二次 待沉淀干燥后 重新加入200 lTE溶解 20 贮存 备用 DNA的紫外分光光度计检测 原理 核酸在260nm处有最大吸收峰蛋白质在280nm处有最大吸收峰盐和小分子在230nm处有最大吸收峰OD260 OD280 1 7OD260 OD230 2 01OD260 50
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