CaCo2培养方法.doc

CaCo2细胞培养1. 培养条件在37C、5% CO2 及饱和湿度条件下培养2. 培养基的配制（1） 称取 DMEM粉末（GiBico Cat No.12100-046） 1包(13.4 g/L)NaHCO3 (分析纯) 3.7 g/LHEPES (Sigma H3376) 1.3g/LGlucose (分析纯) 3.5 g/L溶于1 L重蒸水中，搅拌溶解，调pH至7.4（2）加入青霉素（10万U/mL）和链霉素（100 万U/mL）各一管非必须氨基酸 100 mL（3）置于超净台内过滤除菌，将过滤好的培养液分装入小瓶内置于4C冰箱内待用。（4）加入10%胎牛血清（天津 TBD Cat No.TBD31HB）即为完全培养基。最终配成含10%胎牛血清、青霉素（100 U/ml）和链霉素（100 mg/ml）的DMEM培养液3. 青、链霉素溶液的配制与消毒具体操作均在超净台内完成。青霉素(华北制药股份有限公司)是80万单位/瓶，用注射器加8 mL灭菌重蒸水。链霉素是100万单位/瓶，加10 ml(华北制药股份有限公司)灭菌重蒸水，即每毫升各为10万单位。4. 谷氨酰胺的配制与消毒合成培养基中都含有较大量的谷氨酰胺，其作用非常重要，细胞需要谷氨酰胺合成核酸和蛋白质，谷氨酰胺缺乏要导致细胞生长不良甚至死亡。在配制各种培养液中都应该补加一定量的谷氨酰胺。由于谷氨酰胺在溶液中很不稳定，4C下放置1周可分解50，故应单独配制，置于-20C冰箱中保存，用前加入培养液。加有谷氨酰胺的培养液在4C冰箱中储存2周以上时，应重新加入原来的谷氨酰胺。一般培养液中谷氨酰胺的含量为14 mmol/L。可以配制200 mmol/L谷氨酰胺液贮存，用时加入培养液。配制方法为，谷氨酰胺2.922 g溶于三蒸水加至100 ml即配成200 mmol/L的溶液，充分搅拌溶解后，过滤除菌，分装小瓶，-20C保存，使用时可向100ml培养液中加入1ml谷氨酰胺溶液。一般买的DMEM培养基中含有谷氨酰胺，第一次配制无需再加入。5. 0.25%胰酶-0.02%EDTA的配制与消毒称取胰酶0.25g（Biosharp Cat No. AM0458），0.02 g EDTA（生化试剂），0.8 g NaCl（分析纯），0.348 g Na2HPO412H2O/0.29 g Na2HPO4（分析纯），0.02 g KCl（分析纯），0.02 g KH2PO4（分析纯）溶于100 mL重蒸水中，搅拌溶解，调pH至7.4，于超净台内过滤分装，-20C保存，4C短期内用完。6. 胰酶消化一个T25瓶的Caco2细胞（1）去除培养基。（2）用4ml DPBS（HyClone Cat No.SH30028.018）洗涤细胞，去除DPBS。 （3）加入400 mL0.25%胰酶-0.02%EDTA（恰好覆盖细胞表面）。（4）37 孵育10分钟左右。（5）待细胞消化完全（倒置显微镜下观察消化细胞，若胞质回缩，细胞之间不再连接成片，表明此时细胞消化适度）向细胞中加入4ml 细胞培养液（培养基中的FBS终止了胰酶的活性），反复吹打细胞。（6）将细胞转移至离心管中，离心（1000 rpm 5 min）沉淀细胞，去除培养基。（7）用新的培养基重新悬浮细胞