微生物综合实验 枯草芽孢杆菌.doc

精品文档枯草芽孢杆菌的分离、提纯摘要 枯草芽孢杆菌，是芽孢杆菌属的一种。单个细胞0.70.823微米，着色均匀。无荚膜，周生鞭毛，能运动。革兰氏阳性菌，芽孢0.60.91.01.5微米，椭圆到柱状，位于菌体中央或稍偏，芽孢形成后菌体不膨大。菌落表面粗糙不透明，污白色或微黄色，在液体培养基中生长时，常形成皱醭。需氧菌。可利用蛋白质、多种糖及淀粉，分解色氨酸形成吲哚。在遗传学研究中应用广泛，对此菌的嘌呤核苷酸的合成途径与其调节机制研究较清楚。广泛分布在土壤及腐败的有机物中，易在枯草浸汁中繁殖。关键词 枯草芽孢杆菌 提纯 无菌 培养一、实验目的1、学习从土壤中分离、纯化枯草芽孢杆菌的原理和方法。2、学习和掌握枯草芽孢杆菌的鉴定方法。3、锻炼培养学生综合应用微生物实验方法的能力。4、培养学生自行设计实验流程、综合分析问题解决问题和判断实验结果的能力。二、实验原理芽孢是芽孢杆菌属和梭菌属细菌生长到一定阶段形成的一种抗逆性很强的休眠体结构，也被称为内生孢子，通常为圆形或椭圆形。枯草培养法是利用枯草杆菌产生芽孢这一性质。因为芽孢对不良环境有较强的抗性。所以枯草在煮沸过程中，不含芽孢的细菌被杀死，而含有芽孢的枯草杆菌能够生存下来，在适宜的条件下进行繁殖生长。芽孢染色法是利用同一种细菌的芽孢和菌体对不同染料的亲和力不同的原理，用不同的染料进行着色，因芽孢壁厚，透性低，着色脱色均较困难，而使芽孢和菌体呈不同的颜色便于区分。因此芽孢染色采用弱碱性染料孔雀绿，在加热的条件下进行，因孔雀绿与菌体结合较差，所以易被水冲洗掉，而芽孢中的孔雀绿却难溶出，水洗后，再用一种呈红色的碱性染料加以复染，结果，菌体为红色，芽孢为绿色。三、实验器材1、培养基淀粉培养基蛋白胨2gNaCL1g牛肉膏1g可溶性淀粉0.4g蒸馏水200ml琼脂34g灭菌121度 20min2、材料： 枯草3、器材：显微镜、三角烧瓶、温箱、酒精灯、棉塞、接种环、无菌玻璃涂棒、无菌吸管、无菌培养皿、涂布器等。4、流程：倒平板制备枯草稀释液涂布培养初筛复筛四、实验步骤1、土样的采集：取土壤表层5-10cm下的肥土100g左右，把采取的土壤放入纸袋带回实验室。2、培养基的制备(1)称量：按培养基配方比例依次准确地称取牛肉膏、蛋白胨、NaCL放入烧杯中。牛肉膏称量后直接放入水中，这时如稍微加热，牛肉膏便会与称量纸分离，然后立即取出纸片。（2）熔化：在烧杯中加入所需要的水量，用玻璃棒搅匀，然后，在石棉网上或磁力搅拌器上加热溶解。（3）分装和加塞：将配制的培养基分装入试管内，在试管口或锥形瓶口上塞上棉塞。（4）包扎：加塞后，将全部试管用麻绳捆好，再在棉塞外包一层牛皮纸，其外再用一根麻绳扎好。用记号笔注明培养基名称、组别、配制日期。（5）灭菌：将上述培养基以0.1MPa，121摄氏度，20min高压蒸汽灭菌。（6）搁置斜面：将灭菌的试管培养基冷却至50摄氏度左右，将试管口端搁在玻璃棒上。斜面的斜度要适当，使斜面的长度约为管长 1/3。（7）无菌检查：将灭菌培养基放入37摄氏度的培养箱中培养2428h，以检查灭菌是否彻底。3、分离（1）倒平板将淀粉培养基加热熔化待冷却至55-60c时倒入培养皿。倒平板的方法：右手持盛培养基的试管或三角瓶置于火焰旁边。用左手将试管塞或瓶塞轻轻拔出，试管口或瓶口保持对着火焰；然后左手拿培养皿并将皿盖在火焰近打开一缝，迅速倒入培养基约15ml，加盖后轻轻摇动，平置于桌面上，待凝后即为平板。（2）制备枯草稀释液将枯草数根剪碎，放入三角瓶和电磁炉中，在三角瓶加入适量的氢氧化钙，在电磁炉中不加氢氧化钙。加水浸过枯草。塞好棉塞煮沸五分钟。杀死无芽孢的细菌。用一支试管从中吸取1ml枯草悬液盛入放有9ml无菌水的试管中充分混匀，然后从此试管中吸取1ml加入盛有9ml无菌水的试管中，混合均匀，以此类推，制成10-1、10-2、10-3、10-4、10-5不同稀释度的枯草溶液。（3）涂布将上述每种的三个平板底面分别用记号笔写上10-3、10-4、10-5三种稀释度，然后用无菌吸管分别由10-3、10-4、10-5三管枯草稀释液中各吸取0.2ml，小心滴在对应平板培养基表面中央位置。用无菌涂布器涂布。右手拿无菌涂布器平板培养基表面上，将菌悬液先沿同心圆方向轻轻地向外扩展，使之分布均匀，室温下静置5-10min，使菌液浸入培养基。 （5）培养将淀粉培养基平板倒置于37c培养箱中培养1-2d。（6）初筛观察菌落表面粗糙不透明，呈污白色或微黄色，将这样单个菌落分别挑取少许细胞接种培养基上，置于37c的培养箱中培养1-2d 。（7）复筛从上述培养基中分别挑出培养基挑取2个单菌落中部分菌体，在淀粉培养基上划线纯化，将培养基放在37度培养箱中培养1-2d。保存。五、注意事项1、选用适当菌龄的菌种，幼龄尚未形成芽孢，而老龄芽孢囊已破裂。2、加热染色时必须维持在染液微冒蒸汽的状态，加热沸腾会导致菌体或芽孢囊破裂，加热不够，芽孢难以着色。3、脱色时必须等待拨片冷却后进行，否则骤然用冷水冲洗，会导致玻片破裂。4、注意土样的处理，以除去大部分的细菌。六、实验结果及分析1、简单染色法简单染色是利用单一染料对细菌进行染色的一种方法。此法操作简便，适于菌体一般形状和细菌排列的观察。常用碱性染料进行简单染色，这是因为：在中性、碱性和弱酸性溶液中，细菌细胞通常带负电荷，而碱性染料电离后带有正电荷，很容易与菌体结合使细菌着色。所以，在染色后紫色的为枯草芽孢杆菌。2、芽孢染色法芽孢染色法是利用同一种细菌的芽孢和菌体对不同染料的亲和力不同的原理，用不同的染料进行着色，因芽孢壁厚，透性低，着色脱色均较困难，而使芽孢和菌体呈不同的颜色便于区分。因此芽孢染色采用弱碱性染料孔雀绿，在加热的条件下进行，因孔雀绿与菌体结合较差，所以易被水冲洗掉，而芽孢中的孔雀绿却难溶出，水洗后，再用一种呈红色的碱性染料加以复染，结果，菌体为红色，芽孢为绿色。分析：枯草芽孢杆菌的分离提纯实验结果中枯草芽孢少而且不是很纯，可能有以下几个原因：由于加入的Ca(OH)2的量过多，导