细胞壁成分测定.doc

_一、杏鲍菇(pleurotus eryngii)冷藏保鲜技术及自溶机理研究（巩晋龙2013福建农林大学）细胞壁物质成分(蛋白质、可溶性糖、几丁质、纤维素)的测定(1) 细胞壁乙醇不容物(AIS)的制备：参照Zivanovic S et al.等144方法并做一些修改：取混匀后的样品组织200 g于95%的乙醇溶液中浸提10 min，然后煮沸5 min，放置于室温下沉淀过夜，过滤，残渣用78%乙醇进行洗涤，过滤后60 真空干燥过夜，置于干燥器中冷却至室温，干样经粉碎后过筛，即得乙醇不容物(AIS)。(2) 细胞壁物质成分的测定： 乙醇不容物(AIS)中可溶性蛋白质含量的测定参照考马斯亮蓝染色法117，以标准牛血清蛋白溶液制作标准曲线。精确称取 25 mgAIS，加蒸馏水，浸提 10 min，12000g 离心20 min，吸取 1.0 mL 上清液于 10 mL 容量瓶并定容至刻度。吸取 1.0 mL 样品提取液，放入具塞试管中，加入 5.0 mL 考马斯亮蓝 G-250 溶液，充分混合，放置 2 min 后在波长 595 nm 处比色测定其吸光度，重复 3 次，计算可溶性蛋白质的含量。 乙醇不容物(AIS)中可溶性糖含量的测定采用苯酚-硫酸法117以标准蔗糖溶液制作标准曲线。精确称取 25 mgAIS 于 20 mL 具塞试管中，加入 10 mL 蒸馏水，薄膜封口，沸水中煮沸提取 30 min，冷却、过滤，将残渣回收到试管中，加 10 mL 蒸馏水，重复沸水浴提取 10 min，过滤，洗涤，将滤液一并转入 50 mL 容量瓶并定容至刻度。吸取 1.0mL 提取液于具塞试管中，加入 1.0 mL 蒸馏水，1.0 mL 0.09 g/mL 苯酚溶液，摇匀，再加入 5.0 mL的浓硫酸，充分振荡后在室温下反应 30 min，在波长 485 nm 处比色测定其吸光度，重复3 次，计算可溶性糖的含量。 乙醇不容物(AIS)中几丁质的测定方法参照傅海舰等145，以标准 D-氨基葡萄糖盐酸盐溶液制作标准曲线。精确称取 25 mg 于 25 mL 容量瓶中，加入 5 mL 2 mol/L 盐酸溶液溶胀，混匀后，冰水浴中加入 15 mL 浓硫酸，沸水中煮沸 30 min，冷却至室温，去离子水定容至刻度。吸取水解液 1 mL 与 10 mL 容量瓶中，依次加入 1.0 mL 2%间苯二酚水溶液、7.5 mL 75%浓硫酸溶液，混匀，沸水浴加热 30 min，凉水冲至室温，定容，以空白作对照，在 500 nm 处比色测定其吸光度，重复 3 次，计算几丁质含量。 乙醇不容物(AIS)中纤维素含量的测定方法参照宁正祥等146以标准葡萄糖溶液制作标准曲线。精确称取 0.5 gAIS 与烧瓶内，加入 120 mL 2%盐酸溶液，回流煮沸 3 h，抽滤，用热水洗涤 23 次，抽干，再用乙醇和乙醚洗涤 1 次，低温烘干。用 20 mL 80%硫酸溶液将其转移到锥形瓶内，摇匀，放置 2 h，加入 300 mL 蒸馏水，置于沸水浴中加热 5 h，冷却，过滤至 500 mL 容量瓶并用蒸馏水定容至刻度。取 0.5 mL 样品提取液加入 25 mL 具塞刻度试管中，加 1.5 mL 蒸馏水、0.5 mL 蒽酮-乙酸乙酯试剂和 5.0 mL 浓硫酸，充分振荡，沸水浴加热 1 min，冷却至室温，在 630 nm 处比色测定其吸光度，重复 3 次，计算纤维素含量。二、主要食用菌采后品质劣变机理及调控技术研究（姜天甲2010浙大）1 细胞壁乙醇不溶物(alcohol-insoluble residue,AIR)的提取乙醇不溶物(AIS)的制备参照Zivanovicetal.(2000)等的方法。细胞壁各组分抽提参照Sietsmaetal.(1981)的方法并做了些修改:取20omgAIS,用煮沸的蒸馏水15mL抽提Zh,提取溶液在4oc经13000只g离心20min,收集上清液并定容至25mL得水溶性组分;取水不溶性沉淀,以IMNaoH溶液15mL在60OC下抽提20min,旋转离心,收集上清液并用冰醋酸将PH值调至7.0,定容至25mL得IMNaOH可溶性组分;取IMNaOH不溶残渣,以10MNaOH溶液15mL煮沸并抽提111,旋转离心,收集上清液并用冰醋酸将PH值调至7.0,定容至25mL得IOMNaOH可溶性组分;取IOMNaOH不溶残渣,以6MHel溶液smL煮沸并抽提4h,旋转离心后收集上清液,残渣用IMNaOH溶液10mL在60oC下抽提20mill,旋转离心并收集上清液,将这两部分上清液合并然后用水定容至25mL得HCI/IMNa0H可溶性组分;剩余不溶物为残渣组分。2 细胞壁物质成分的分离和测定乙醇不溶物(AIS),水溶性组分与1MNaoH可溶性组分中的可溶性蛋白含量参照Bradford(1976)的方法进行测定,以牛血清白蛋白制作标准曲线。吸取提取液一lmL于试管中,然后加入smL考玛斯亮蓝G一250试剂,混合均匀,放置5min后在595nm下比色测定吸光度,计算可溶性蛋白含量。乙醇不溶物(A工S)与所有组分中的可溶性糖含量测定采用葱酮比色法(曹建康等,2007),以蔗糖制作标准曲线。吸取提取的上清液lmL于试管中,加lmL蒸馏水,O.smL葱酮乙酸乙醋和smL浓流酸,充分振荡后立即放入沸水浴中保温lmin,取出后自然冷却至室温,以空白作参比,在63Onm波长下测其吸光度,计算可溶性糖含量。乙醇不溶物(AIS)与所有组分中的几丁质的测定方法参照傅海舰等(2003),以D一氨基葡萄糖盐酸盐制作标准曲线。吸取水解液lmL于10mL的容量瓶中,加2%间苯二酚水溶液lmL,然后加入75%的浓硫酸溶液7.smL混匀,沸水浴中加热3omin,凉水冲至室温,定容,以空白作参比,在soonm波长下测其吸光度,计算几丁质含量。乙醇不溶物(AIS)中的纤维素含量参照UPdegraff(1969)的方法进行测定,以纯纤维