有机波谱分析第1章 质谱.ppt

仪器分析原理与实验 下 有机波谱分析 武汉理工大学本科生课程 现代仪器分析法 是化合物结构测定和成分分析的重要手段 被广泛的应用于有机化合物的结构分析中 具有样品用量少 结构信息丰富等特点 波谱分析大大缩短了复杂化合物结构测定的时间 解决了很多领域如 蛋白质 核酸 多糖的结构测定等难点 并广泛的应用于各个研究领域 结构表征最常用的仪器分析方法 质谱 MS 紫外光谱 UV 红外光谱 IR 核磁共振谱 NMR X射线光电子能谱 XPS 纯度确定 分子式确定 结构解析的常规程序 不饱和度确定 平面结构式确定 立题构型构象确定 蒸馏 分馏 萃取 重结晶HPLC GC等 元素分析 HRMS NMR n 1 nH 2 nX 2 nN 2 UV IRMS NMR CD ORDNOE x ray 红外光谱 紫外光谱 质谱 未知化合物的结构测定 课程内容 质谱紫外光谱红外光谱核磁共振氢谱核磁共振碳谱多谱综合解析 课程的目标 通过本课程的学习充分掌握四大波谱技术基本原理能充分运用谱学信息正确解释谱图各谱学信息的综合分析及结构的正确推导 教材与参考书目 教材 孟令芝等编著 有机波谱分析 武汉大学出版社 2010年 第三版 参考书目 1 宁永成 有机化合物结构鉴定与有机波谱学 科学出版社 2000年 2 宁永成 有机波谱学谱图解析 科学出版社 2012年 3 WilliansDH Spectroscopicmethodsinorganicchemistry McgrawHill 1980 考核方式与要求 第一章有机质谱 质谱的基本知识分子离子峰和分子式离子裂解的机理常见各类化合物的质谱有机质谱的解析及应用最新质谱技术及应用简介 质谱 massspectrometry 的基本知识 质谱分析法是通过对被测样品离子的质荷比 m z 的测定来进行分析的一种分析方法 质谱图是唯一能够得到未知物相对分子质量的工具 高分辨质谱可以得出未知物的分子式 为推测一个未知物的结构 质谱也是必不可少的 12 了解质谱仪构造与原理 不同离子化的方法及质谱仪的特点掌握质谱基本知识 质谱术语掌握分子离子峰的识别及分子式的推导掌握有机化合物的一般裂解规律运用一般裂解规律 解析未知物的质谱 推导其结构 本章学习的基本要求 13 质谱常用术语 分子离子MolecularionM 被电离了的分子 表示分子离子带一个电子电量的正电荷 表示它有一个不成对电子 碎片离子由分子离子在离子源中碎裂生成的 奇电子离子外层有未成对电子的离子 偶电子离子外层电子全部成对的离子 同位素峰元素组成中含有一个非最高天然丰度的同位素 亚稳峰metastableionm 离子从离子源出口到达检测器之前产生并记录下来的离子 子离子离子碎裂反应产生的离子 14 基峰谱图中表现为最高峰度离子的峰 负离子通过电子捕获及电离时形成离子对等机理产生的 含电负性原子F Cl O N等的化合物产生负离子的产率较高 准分子离子quasi molecularion M H 简单断裂仅涉及一个键断裂的离子分解反应重排指一个反应 其离子或中性产物中的原子排列与前体离子不同 断裂与奇电子原子邻接原子的键断裂 化学均裂转移一个电子 i断裂涉及到一对电子的转移 是化学键异裂的 同时正电荷位置发生转移 全箭头 电子对转移 鱼钩 单个电子转移 一 质谱构造和工作原理 1 气体扩散2 直接进样3 气相色谱 1 电子轰击2 化学电离3 场致电离 1 单聚焦2 双聚焦3 飞行时间4 四极杆 质谱图是以质荷比 m z 为横坐标 相对强度为纵坐标构成 一般将原始质谱图上最强的离子峰为基峰并定为相对强度为100 其它离子峰以对基峰的相对百分值表示 真空系统vacuumsystem质谱仪的离子产生及经过系统必须处于高真空状态 离子源真空度应达1 3 10 4 1 3 10 5Pa 质量分析器中应达1 3 10 6Pa 其作用是减少离子碰撞损失 真空度过低 将会引起 a 大量氧会烧坏离子源灯丝 b 引起其它分子离子反应 使质谱图复杂化 c 用作加速离子的几千伏高压会引起放电 一般质谱仪都采用机械泵预抽空后 再用高效率扩散泵连续地运行以保持真空 现代质谱仪采用分子泵可获得更高的真空度 机械泵turbopump 扩散泵Diffusionpump 不同气压下聚乙烯乙二醇400的MALDI TOF图谱 真空系统的压强范围 2 进样系统进样系统的作用是在不破坏真空度的情况下 使样品高效重复的进入离子源 常用的进样装置有三种类型 间歇式进样 直接探针进样 色谱进样系统 GC MS HPLC MS 和高频感藕等离子体进样系统 ICP MS 等 2 间歇式进样 适于气体 沸点低且易挥发的液体 中等蒸汽压固体 1 色谱进样 利用气相和液相色谱的分离能力 与质谱仪联用 进行多组份复杂混合物分析 3 离子源ionizationsource 功能是将气态样品分子转化成离子 由于离子化所需要的能量随分子不同差异很大 因此 对于不同的分子应选择不同的离解方法 通常称能给样品较大能量的电离方法为硬电离方法 而给样品较小能量的电离方法为软电离方法 后一种方法适用于易破裂或易电离的样品 常见的离子源包括 A 电子轰击电离源 ElectronImpact EI 化学电离源 ChemicalIonization CI 场电离源 FieldionizationSources FI B 电喷雾源 ElectronsprayIonization ESI 基质辅助激光解吸电离源 MatrixAssistedLaserDescriptionIonization MALDI 电子轰击电离源 EI源 应用最为广泛的离子源 它主要用于挥发性样品的电离 EI源的原理 由气相色谱或直接进样杆进入的样品 以气体形式进入离子源 由灯丝在高真空下发出的电子与样品分子发生碰撞使样品分子电离 一般情况下 灯丝与接收极之间的电压为70伏 所有的标准质谱图都是在70eV下做出的 EI源的特点 电离效率高 灵敏度高 应用最广 标准质谱图基本都是采用EI源得到的 稳定 操作方便 电子流强度10 240eV可精密控制 结构简单 控温方便 缺点是只适用于易气化的有机物样品分析 并且 对有些化合物得不到分子离子 e ElectronImpact EI Ionization 电子阱Electrontrap Reflector M 灯丝filament 电势差 电子电离过程 M e M 2e M e M2 3e M e M3 4e 高能电子有效碰撞到分子 分子得到能量 如分子得到的能量超过其电离能 ionizationenergyIE 那么最可能的过程是分子放出一个电子成为分子离子M 二价或三价分子离子也有可能被观察到 但是丰度较低 电子电离效率 大部分有机物的电离能IE在7 15eV之间 每种物质电离效率由分子性质和电离截面决定 对大多数有机物来说它们的电离截面vs电子能的曲线大致相同 因此EI谱图电子能大都在70eV 70eV下所有分子都会电离70eV附近电离截面变化不大 谱图重现性好 EI源的进样系统 直接嵌入杆DIP directinsertionprobe 试样可以是小的固体颗粒 蜡状或高沸点液体 进样时置于小瓶内被加热汽化 EI源的进样系统 直接暴露杆DEP directexposureprobe 试样可以是小的固体颗粒或膜 进样时置于离子源内 当分析物直接暴露在高能电子下电离 称之为解直接电子电离 drectionelectronionization 或解吸电离 desorptionionizationDEI 亮氨酸和赖氨酸的DEI EI谱图对比 化学电离源 CI源 有些化合物稳定性差易分解 用EI方式不易得到分子离子 因而也就得不到分子量 CI和EI在结构上没有多大差别 或者说主体部件是共用的 其主要差别是CI源工作过程中要引进一种反应气体 通常是甲烷 异丁烷等 灯丝发出的电子首先将反应气电离 然后反应气离子与样品分子进行离子 分子反应 并使样品气电离 现以甲烷作为反应气 说明化学电离的过程 CH4 e CH4 CH3 CH2 CH C H 2e 甲烷离子与分子进行反应 生成加合离子 CH4 CH4 CH5 CH3CH3 CH4 C2H5 H2加合离子与样品分子反应 CH5 XH XH2 CH4C2H5 XH X C2H6生成的XH2 和X 比样品分子XH多一个H或少一个H 可表示为 M 1 称为准分子离子 事实上 以甲烷作为反应气 除 M 1 之外 还可能出现 M 17 M 29 等离子 同时还出现大量的碎片离子 由于CI得到的质谱不是标准质谱 所以不能进行库检索 CI特点 最强峰为准分子离子谱图简单不适用难挥发试样 39 EI和CI谱图例子 EI CI a EI源 b CI源 甲烷 c CI源 异丁烷 图1 4邻苯二甲酸二辛酯的质谱图 41 场致电离源 FieldionizationFI 电压 7 10kV d 1mm 强电场将分子中拉出一个电子 分子离子峰强 碎片离子峰少 不适合化合物结构鉴定 42 适合于对热不稳定或不易汽化的样品 快原子轰击 fastatombombardment FAB FAB 是一种广泛应用的软电离技术 快原子轰击利用的重原子一般为He或Ar 图1 5FAB离子源原理示意图 FAB可完成连FD都有困难的 高极性 难汽化的化合物的电离 样品多调匀于基质 一般为甘油等 中 FAB得到的是准分子离子峰 M H 当分析极性样品 糖类 常加入NaCl水溶液 得到 M Na 离子峰 基质辅助激光解吸电离 matrix assistedlaserdesportionionization MALDI a 猪细胞色素c porcinecytochromC b 某单克隆抗体的MALDI TOF质谱图 优点 1 使一些难于电离的样品电离 且无明显的碎裂 质量数可达300 000Da2 特别适用于与飞行时间质谱相配 MALDI TOFMS 3 准分子离子峰 M H 或 M metal 较强 电喷雾电离 electrosprayionization ESI 主要应用于高效液相色谱HPLC与质谱仪的联用 从雾化器套管的毛细管端喷出的带电液滴 随着溶剂的不断快速蒸发 液滴迅速变小 表面电荷密度不断增大 由于电荷间的排斥作用 就会排出溶剂分子 得到样品的准分子离子 通常小分子得到带单电荷的准分子离子 而大分子则得到多种多电荷离子 检测质量可提高几十倍 ESI是很软的电离方法 通常无碎片离子峰 只有整体分子的峰 十分有利于生物大分子的质谱测定 1356 6 M 49H 49 1384 5 M 48H 48 1413 9 M 47H 47 m z Ion series 牛血清蛋白bovineserumalbumin MW 6 7 104 2 质量分析器质量分析器的作用是将离子源产生的离子按m z顺序分开并排列成谱 质量分析器有A 磁式单聚焦分析器 SingleFocusing B 磁式双聚焦分析器 DoubleFocusing C 四极杆分析器 Quadrupole D 离子阱分析器 IonTrap E 飞行时间分析器 TimeofFlight F 傅立叶变换回旋共振分析器 FourierTransformIonCyclotronResonance FTICR 51 A磁分析器 单聚焦质谱计 52 加速后的离子进入磁场 其运动方向 I 和磁力线的方向 H 相互垂直 离子受到一个与其运动方向和磁力线的方向都垂直的力 F 的作用 三者的关系可用左手定则确定 离子沿着I和H合力的方向运动 即受到磁场的偏转作弧形运动 电场加速后zV 1 2 m 2 z 电荷 V 电压 m 质量 速度 磁场中Bz m 2 r B 磁场强度 r 半径 推出m z B2r2 2V 扫描B V来获得质谱图 B 磁式双聚焦分析器 DoubleFocusing C 四极杆质量分析器 quadrupolemassanalyzer 四极质谱仪的质量分析器 简写为Q 是由四根棒状电极组成 两对电极中间施加交变射频场 在一定射频电压与射频频率下 只允许一定质量的离子通过四极分析器而到达接收器 D 离子阱 iontrap 分析器 与四极杆分析器类似 也有类似四极杆分析器的稳定图 样品的离子引入并储存在圆形电极和一组射频电极组成的离子盒中 改变射频逐个拉出所有的离子 E 飞行时间质谱计 timeofflight TOF 用一个脉冲将离子源中的离子瞬间引出 经加速电压加速 它们具有相同的动能进入漂移管 质荷比小的离子具有最快的速度因而首先到达检测器 质荷比大的离子则最后到达检测器 图1 10配离子反射镜的飞行时间质谱示意图 在离子源中产生的离子经电压V加速后获得的速度为 式中 ze是离子的电荷 m是其质量 经过长度为L的漂移管到达检测器 离子飞行需要的时间从上述二公式看出 质量越大的离子飞行速度越小 到达检测器所需的时间也越长 两个质量分别为m1和m2的离子的飞行时间之差 仪器的质量分辨率可近似地由时间表示 由此可见 提高加速电压 使离子的飞行时间缩短 仪器分辨率就下降 而增加漂移管的长度 使离子的飞行时间增加 仪器分辨率就提高 优点 1 检测离子的质荷比范围非常宽2 扫描速度快 适合研究极快过程3 高分辨率4 灵敏度高 适合于作串联质谱的第二级5 特别适合于与脉冲产生离子的电离源 MALDI TOF 缺点 分辨率随质荷比的增加而降低 E 飞行时间质谱计 timeofflight TOF 假定质荷比m e的离子进入磁感应强度为B的磁场中mv2 R Bev整理后得 v R Be m或 c Be m在分析器上施加一个频率使离子产生迥旋共振离子都发生感生相电流的衰减信号这种干扰谱图处理并进行傅立叶变换 便可检出各种频率成分的谱图 频域谱 并利用频率与量的关系 得到常见的质谱图 F 傅立叶变换回旋共振分析器 Fouriertransformioncyclotronresonance FT ICR 优点 1 分辨率极高 可达1 106 但不导致灵敏度下降 2 可实现多极 时间上 的串联质谱 3 灵敏度高 质量范围宽 速度快 性能可靠 3 检测器 质谱仪的检测主要使用电子倍增器 也有的使用光电倍增管 由四极杆出来的离子打到高能打拿极产生电子 电子经电子倍增器产生电信号 记录不同离子的信号即得质谱 质谱仪的主要性能指标质量范围 massrange 质谱仪所能进行分析的样品的相对原子质量 或相对分子质量 范围 通常采用原子质量单位 u 进行度量 有机质谱仪一般可达几千 现代质谱仪甚至可以研究相对分子量达几十万的生化样品 质谱仪所能测定的离子质荷比的范围 磁分析器 200四极质谱 1000离子阱质谱 6000飞行时间质谱 无上限 2 分辨率 resolution 分辨率R是指质荷比相邻的两质谱峰的分辨能力 若近似等强度的质量分别为M1及M2的两个相邻峰正好分开 则质谱仪的分辨率定义为 国际上 1 R10 两峰间的峰谷高度为峰高的10 时的测定值 2 一般难以找到两个质量峰等高 且重叠的谷高正好等于峰高的10 则定义 R 式中a为其中一峰的峰高5 处的峰宽 b为相邻两峰的中心距离 低分辨率质谱仪 R 1000高分辨率质谱仪 R 10000 FT ICRMS R可达1 106 利用高分辨率质谱仪可测定精确的质量数 分子式 质荷比均为28的分子 CO 27 9949N2 28 0062C2H4 28 0313 3 灵敏度 sensitivity 对于一定样品 如硬脂酸甲酯 在一定的分辨率情况下 产生一定信噪比 如S N 50 1 的分子离子峰所需的样品量 有机质谱数据库 NIST EPA NIH质谱数据库Wiley NBS质谱数据库 68 质谱的解析是一种非常困难的事情 自从有了计算机联机检索之后 特别是数据库越来越大的今天 尽管靠人工解释EI质谱已经越来越少 但是 通过对化合物分子断裂规律的了解 作为计算机检索结果的检验和补充手段 质谱图的人工解释还有它的优势 特别是未知化合物质谱的解释 另外 在MS MS分析中 对于离子谱的解释 目前还没有现成的数据库 主要靠人工解释 因此 学习一些质谱解析方面的知识非常必要 70 有机质谱提供分子结构的信息包括 分子量元素组成由裂解碎片检测官能团 辨认化合物的类型 推导碳骨架 质谱的图谱分析 一 分子量的测定 找到分子离子峰 分子失去一个价电子而生成的离子称为分子离子M 质谱图上质荷比最大的峰一定为分子离子峰吗 如何鉴别分子离子峰 质谱图上质荷比最大的峰一定为分子离子峰吗 如何鉴别分子离子峰 采用EI 大约20 的分子离子峰弱或不出现 其大致规律如下 羰基化合物 醛 酮 酸 酯 酰氯 酰胺 分子离子峰通常可见 脂肪族醇类 胺类 硝基化合物等分子离子弱或不出现 正确辨认分子离子峰采用的方法 1 从化合物的结构来判断分子离子峰的强度 2 利用经验规律 1 氮原子规则 氮律 凡不含氮或偶数氮原子的分子其分子量必为偶数 而含奇数氮原子的分子其分子量必然为奇数 例如 CH3NH2CH3N NCH3N奇偶M 奇 31 偶 58如果不符合该规律就必然不是分子离子 使用CI电离时 可能出现M H M H M C2H5 M C3H5 使用FAB时 可出现M H M H M Na M K 较高分子量的化合物 可能同时生成M H M 2H M 3H等 2 判断最高质量峰与其他碎片离子峰之间的质量差是否合理 以下质量差一般不可能出现 4 13 19 25 含F例外 37 38 50 53 65 66 如果出现这些质量差 最高质量峰的离子就不是分子离子 如果质量差为14 CH2或N 不可能失去CH2或N 此种情况说明可能有同系物存在 3 根据断裂方式来判断分子离子峰 例如 醇的分子离子往往看不到 但经常可以看到最高质量的两个峰相差三个质量单位 这是由于M CH3和M H2O产生的 假定这两个峰的m e分别为M1和M2 则相对分子量就是M1 15或M2 18 4 注意M 1峰和M 1峰 醚 酯 胺 酰胺 腈 芳基酸酯和胺基醇等的M 1峰较明显 或显著 而醛 醇及含氮化合物的M 1峰较大 3 改变条件检验分子离子峰 1 降低电子流电压 增加分子离子峰的强度 一般为1 12 10 17J 可减少到1 6 10 18 3 2 10 18J 电子流电压降低后高m e值处会出现分子离子峰 2 采用化学电离源 场离子源等电离方法 3 制备容易挥发的衍生物 借助如甲基化 乙酰化 甲酯化 三甲基硅醚化等 将样品制成相应的衍生物 再测定 二 分子式的推导 1 分子式是否合理 符合N律 不饱和度UN 0UN n 1 a 2 b 2n CSia NPb H X FClBrI 单键对不饱和度不产生影响 因此烷烃的不饱和度是0 所有原子均已饱和 一个双键 烯烃 亚胺 羰基化合物等 贡献一个不饱和度 一个叁键 炔烃 腈等 贡献两个不饱和度 一个环 如环烷烃 贡献一个不饱和度 环烯烃贡献2个不饱和度 一个苯环贡献4个不饱和度 例如 C7H3ClN2O2 UN n 1 a 2 b 2 8 1 2 2 3 1 2 7 当S N P为高价态时 计算值会低于分子的不饱和数 2 判断最高质量峰与其他碎片离子峰之间的质量差是否合理 以下质量差不可能出现 4 13 19 25 含F例外 37 38 50 53 65 66 如果出现这些质量差 最高质量峰的离子就不是分子离子 如果质量差为14 CH2或N 不可能失去CH2或N 此种情况说明可能有同系物存在 3 根据断裂方式来判断分子离子峰 例如 醇的分子离子往往看不到 但经常可以看到最高质量的两个峰相差三个质量单位 这是由于M CH3和M H2O产生的 假定这两个峰的m e分别为M1和M2 则相对分子量就是M1 15或M2 184 注意M 1峰和M 1峰 醚 酯 胺 酰胺 腈 芳基酸酯和胺基醇等的M 1峰较明显 或显著 而醛 醇及含氮化合物的M 1峰较大 5 改变条件检验分子离子峰 1 降低电子流电压 增加分子离子峰的强度 一般为1 12 10 17J 可减少到1 6 10 18 3 2 10 18J 电子流电压降低后高m e值处会出现分子离子峰 2 采用化学电离源 场离子源等电离方法 3 制备容易挥发的衍生物 借助如甲基化 乙酰化 甲酯化 三甲基硅醚化等 将样品制成相应的衍生