与重要疾病相关膜蛋白的结构和功能2009CB918800-G.doc

项目名称：与重要疾病相关膜蛋白的结构和功能首席科学家：施一公 清华大学起止年限：2009.1至2013.8依托部门：教育部一、研究内容本项目将主要进行以下几方面的研究：课题一 解析在老年痴呆症中起关键作用的膜蛋白酶复合物-Secretase的高分辨率晶体结构，在此基础上设计它的抑制剂；（占总经费的32.5%）神经生物学研究证明导致奥兹海默综合症（Alzheimers disease,即老年痴呆症）的重要病原之一是-Amyloid（A）多肽的积累。A来源于Amyloid Precursor Protein (APP)。APP经过几次剪切最终产生出A，其中有两步剪切 （和）是在细胞膜内进行的，而执行这种膜内剪切的蛋白酶是被称为-Secretase的膜整合蛋白酶。与其他膜整合蛋白酶不同的是，-Secretase不是一个单亚基蛋白，而是由四个亚基组成，包括Presenilin（活性位点所在亚基），Aph-1, Pen-2以及Nicastrin，四个亚基总共包含大约18个跨膜螺旋，其中Presenilin含九个，Aph-1六个，Pen-2两个，Nicastrin 一个跨膜螺旋。Presenilin在-Secretase组装的过程中经过剪切后形成两个紧密结合的结构域：NTD和CTD。其活性中心起蛋白酶水解催化作用的关键氨基酸是两个天冬氨酸（Aspartate)，但其具体催化机制至今没有准确解释。-Secretase不仅与老年痴呆症直接相关，而且越来越多的证据表明它可以切割诸多跨膜底物，从而被称为生物膜中的蛋白酶体。因此解析- Secretase复合物的结构具有极其重要的科学价值，其受关注程度与GPCR不相上下。根据现有科研文献报道，- Secretase复合物已经在昆虫细胞及CHO哺乳动物细胞两个表达体系内成功表达及纯化，并具有生物活性，但产率偏低，还不能完全满足大规模尝试结晶的需要。美国及日本的两个实验室分别用电子显微镜观察其构象，得到了15和55两个低分辨率的结构。后者由于分辨率太低，难以提取任何有实质意义的结构信息；前者的结构分析显示- Secretase复合物似乎包含一个亲水性通道使它的活性位点与膜的两侧相通。但是由于分辨率低，很难获得准确、肯定的结论。要揭示- Secretase复合物的结构、工作原理以及根据结构设计其抑制剂，必须获得其高分辨率的原子水平的结构。我们计划同时用昆虫细胞及CHO哺乳动物细胞两个体系通过共表达各个亚基来得到-Secretase复合物，纯化后检测其酶活性，并开始结晶的探索。整个课题的瓶颈有两个，一是摸索合适的条件超量重组表达具有生物活性的-Secretase复合物；二是摸索最优纯化条件及结晶条件。基于我们以前摸索的膜蛋白的研究经验，我们有信心在两至三年内解决这些瓶颈问题，进而进入到晶体学实验及结构解析。本课题中的膜蛋白还没有同源结构。我们将结合计算生物学对这些膜蛋白进行二级结构预测，帮助重组膜蛋白的工程设计，并以此作为模型系统开发膜蛋白的三级结构预测新算法，进一步开发对膜蛋白功能及其它生物化学性质的预测。将这些方法整合成一个膜蛋白结构预测和分析的系统平台。我们也将同时对项目中其他课题组的目标膜蛋白进行预测分析，提供对于膜蛋白重组工程设计等方面的有利帮助，加快实验科学家对目标膜蛋白结构的实验测定。一旦我们获得-Secretase复合物的结构，我们将采用成熟的分子模拟技术开展膜蛋白与配基小分子的分子对接，了解配基结合的机制，开展抑制剂的计算机辅助筛选；开展膜蛋白与其它蛋白的相互作用研究；利用分子动力学模拟研究膜蛋白与其它分子结合的动态过程。通过以上计算，期望获得一些膜蛋白功能的新线索，可用于辅助实验科学家加快对目标膜蛋白的功能鉴定。课题二 解析与心血管疾病有直接关系的胆固醇代谢通路中的重要膜蛋白SCAP，INSIG， SERBP及S2P的高分辨率晶体结构，阐释膜蛋白调控胆固醇代谢通路的分子机理。（占总经费的22.5%）本课题包含以下几方面内容：a. SCAP调控SREBP在细胞中定位的机理：SREBP（Sterol Response Element Binding Protein）是一类极为特殊的转录因子23。它是通过两个跨膜螺旋被固定在内质网膜上的膜整合蛋白,起转录作用的只是它的N端可溶结构域（转录因子）。当细胞内的胆固醇含量降低的时候，这个蛋白首先要从内质网膜转移到高尔基体上，在那里它必须经过两步酶切才能将其N端可溶结构域从膜上释放出来，进而被转运到细胞核中，激活与胆固醇和脂肪酸合成、吸收相关的基因表达，从而提高体内胆固醇的含量23。当细胞内的胆固醇水平足够高的时候,SREBP则被固定在内质网膜上。控制SREBP在细胞中定位的是一个被称为SCAP (SREBP Cleavage Activating Protein)的蛋白。SCAP的C端与SREBP的C端形成复合体,因而SCAP的细胞定位就决定了SREBP的细胞定位。我们希望解析SCAP和SREBP复合体的结构，从而揭示SCAP调控SREBP细胞内定位的分子机理。b. 胆固醇感应蛋白SCAP受胆固醇调控的机理：SREBP定位蛋白SCAP的N端近600个氨基酸形成了8个跨膜螺旋，其中5个螺旋组成被称为“胆固醇感应区”（Sterol Sensing Domain, SSD）的结构域24。通过细胞和生物化学分析，已经知道这个结构域在结合胆固醇时会发生构象变化，使SCAP不能再位于内质网，而转移到高尔基体上，从而携带SREBP也定位到高尔基体25, 26。在那里,SREBP被两个蛋白水解酶S1P和S2P切开，从而释放出N端的转录因子进入到细胞核中，来激活一系列基因的表达。迄今为止，我们对于SCAP这个胆固醇感应区（SSD）被胆固醇调节的机理一无所知，而要阐明这一机理，最强有力的工具就是结构生物学。我们希望解析SCAP中胆固醇感应区单独以及与胆固醇复合物的结构，从而揭示胆固醇调节SCAP构象的原理并且设计胆固醇类似物。该研究对发展新型降血脂的药物具有重要意义。c. INSIG调控SCAP定位的分子机理：INSIG (Insulin-Induced Gene) 包括Insig-1 和Insig-2，是位于内质网膜上的整合膜蛋白，它们在胆固醇水平低的时候，与SCAP形成复合物，从而把SCAP以及与SCAP结合的SREBP“锁定”在内质网膜上；而当胆固醇水平升高，SCAP由于胆固醇感应区构象变化，便与INSIG分离，进而脱离内质网，携带着SREBP进入到高尔基体上27。我们希望解析INSIG本身以及INSIG/SCAP复合物的结构，从而揭示INSIG调节SCAP细胞定位的分子机理。d. 膜内金属蛋白酶S2P的工作机理: 在上述的SREBP经历的两步水解中，第一步水解是由高尔基体腔囊中的一个丝氨酸蛋白水解酶S1P执行的；第二步水解格外有趣，因为切割位点位于SREBP的第二个跨膜螺旋中，即切割点是处于疏水的磷脂双层膜中。而行使切割作用的蛋白酶是一个有着6个跨膜螺旋的膜整合蛋白S2P。 S2P在从细菌到哺乳动物的进化中高度保守，唯一的结构是由施一公教授研究组在2007年底解析的一类古细菌（M. jannaschii）中的同类物16。然而仍有许多问题没有解决，比如高等生物与细菌的S2P结构是否相似；SREBP是如何被S2P识别的；S2P的活性是如何被调控的，等等。我们希望解析真核生物S2P的结构，以及它与其抑制剂的结构从而回答上述问题。e. 膜蛋白的结构预测新算法开发:本课题中的S2P已经有低级生物中的同源结构。我们将以此作为模型系统开发膜蛋白的三级结构预测新算法，包括改进膜蛋白同源模拟中侧链的安装方法，改进膜蛋白Fold Recognition方法中弱同源性检测方法及弱同源序列比对方法；进一步开发膜蛋白其它结构性质的预测。将这些方法整合成一个膜蛋白结构预测和分析平台。同时对项目组中其他实验科学家的目标膜蛋白，进行预测分析，提供关于膜蛋白结构方面的先验知识，以期帮助科学家进行有效的蛋白质工程设计，加快实验科学家对目标膜蛋白结构的实验测定。f. 膜蛋白的分子模拟:一旦我们获得SCAP胆固醇感应区的结构，我们将采用成熟的分子模拟技术开展膜蛋白与配基小分子的分子对接，了解配基结合的机制，开展抑制剂的计算机辅助筛选；开展膜蛋白与其它蛋白的相互作用研究；利用分子动力学模拟研究膜蛋白与其它分子结合的动态过程。通过以上计算，期望获得一些膜蛋白功能的新线索，可用于辅助实验科学家加快对目标膜蛋白的功能鉴定。课题三 探索GPCR的结构与功能及其结构生物学研究的新技术和新方法 （占总经费的22.5%）本课题包含以下几方面内容：a. 使用盒式突变技术（cassette mutagenesis）获得可溶GPCR的研究：GPCR一般由300400个氨基酸残基组成，处于细胞外的N-末端由30-50个氨基酸组成，紧跟着的跨膜疏水区由7个螺旋组成，位于胞内侧的C端氨基酸残基差异较大，是与G蛋白相互作用的区域。我们拟采用渐进式的多位点突变技术，以亲水残基系统性地替换GPCR蛋白跨膜螺旋表面的多个疏水残基，改善GPCR蛋白的水溶性。最终使跨膜结构域的疏水性质得到改变，从而获得与自然状态下在膜系统中核心蛋白形态相似、功能相同的突变GPCR蛋白。拟选择多巴胺受体(Dopamine receptors)作为模式系统，计划建立一个有效的GPCR家族膜蛋白可溶性表达体系，并确定一个切实可行的蛋白质工程策略。该方法将不仅仅适用于GPCR家族蛋白的研究，它对其它膜蛋白结构与功能的研究也具有重要的、开创性意义。b. 使用融合蛋白技术（fusion protein）稳定GPCR构象提高其结晶成功率的研究：GPCR中的7个跨膜螺旋由6个loop区相连，其中连接2-3、4-5和6-7螺旋的loop区在胞外，分别称为E2、E3和E4，连接1-2、3-4和5-6螺旋的loop区在胞内，分别称为C1、C2和C3。比较大的C3 loop区具有很大的柔性和亲水性，与C端共同负责与G蛋白的相互作用。众所周知蛋白质分子的loop区，特别是柔性较大的loop区对蛋白质结晶是非常不利的。美国斯坦福大学和Scripps研究所的研究组通过引入融合T4溶菌酶(T4 lysozyme)的方法稳定了C3loop区并获得了2.4分辨率的2-肾上腺素受体（2-Adrenergic Receptor）的晶体结构。该研究结果发表在2007年11月的Science杂志上并成为2007年度世界十大科学进展之一。显而易见，该方法的成功无论是对GPCR、还是对整个膜蛋白研究领域都产生了巨大的影响。我们拟探索融合蛋白方法在其它GPCR结构生物学研究中的应用。以多巴胺受体(Dopamine receptors)作为模式系统，研究融合蛋白方法稳定GPCR膜外loop区的构象，增大蛋白质分子间特异性相互作用区域，从而改善结晶成功率。我们拟联合使用盒式突变技术和融合蛋白技术，希望获得1-2个多巴胺受体或其它膜蛋白的晶体结构，并对其结构与功能的关系以及与之相关的潜在药物或先导化合物进行深入的研究。课题四 肺炎链球菌表面膜蛋白的结构与功能研究（占总经费的22.5%）肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)是链球菌属革兰氏阳性菌，呈矛头状，成双排列，在痰和脓液中常形成短链状，无鞭毛，在人和动物体内可产生荚膜。该菌经常存在于正常人的鼻腔中，当机体免疫力下降时，尤其在呼吸道病毒感染后或婴幼儿、年老体弱者易发生肺部感染，还可引发脑膜炎、胸膜炎、菌血症和中耳炎等严重疾病。肺炎链球菌是人类主要的致病菌之一，全世界每年约160万人因感染致病死亡。我国每年约有250万人患肺炎链球菌性肺炎，并造成其中12万人死亡，其危害远远大于麻疹和疟疾，是导致5岁以下儿童死亡的头号疾病。由于抗生素的大量使用，肺炎链球菌出现对青霉素和大环内酯类抗生素耐药，并且出现对其它抗生素的多重耐药，因此疫苗在感染预防中的作用越来越重要。 存在于肺炎链球菌表面的约500多种膜蛋白及膜表面蛋白在疾病发生过程中起着非常重要的作用，它们是细菌毒力和免疫逃逸系统的主要作用分子，同时也是药物设计的首选靶标和疫苗研发的重点。这些蛋白质大多数为毒力因子，它们通过共价连接或其它方式结合在细胞壁或细胞膜上，在肺炎链球菌的定殖和侵入过程中发挥功能。针对膜蛋白及膜表面蛋白研发蛋白质疫苗具有其它疫苗无法比拟的优势：生产成本低、对所有年龄组的人群产生保护作用、诱发免疫记忆等。但是目前，对这些表面蛋白的结构以及它们的毒力和免疫反应机制仍然知之甚少37。这些重要蛋白质三维结构的解析将为更为高效的新疫苗的研发和基于三维结构的新药设计提供重要的理论依据。肺炎链球菌的大部分膜蛋白及膜表面蛋白按照结构特征可以分为三大类：通过与磷酸胆碱的非共价结合而固定在细胞壁上的胆碱结合蛋白（choline-binding proteins, CBPs）、具有LPxTG motif的sortase的底物蛋白、镶嵌于细胞膜中的脂蛋白（主要包括各种不同的转运蛋白）。我们将利用X射线晶体学手段解析上述蛋白中具有免疫原性的膜表面蛋白及其与宿主受体蛋白的复合物的精细三维结构，尝试利用杆状病毒介导的昆虫表达系统和酵母表达系统超量表达第三大类蛋白镶嵌于细胞膜中的一些重要的转运蛋白并进行纯化、结晶和结构解析。对于一些重要的作用位点和相互作用界面，我们将利用核磁共振波谱学手段研究分子识别过程中的动力学特征。另外，对于一些新发现的功能未知的膜蛋白及膜表面蛋白，我们将利用微生物遗传学方法结合分子生物学手段研究其表达调控和生理功能，同时对基于蛋白质三维结构设计的抑制剂的功效进行系统验证和评估。二、预期目标总体目标：膜蛋白结构生物学是当今结构生物学研究的最前沿、最重要的领域之一，已知的膜蛋白结构只有350个，其中还包含了大量外膜蛋白、同类膜蛋白的同源物、突变体等等，因此新颖膜蛋白的结构信息极其贫乏。我们的总体目标是解析有重要科学价值并与重大疾病相关的新型膜蛋白的高分辨率结构，探索真核膜蛋白表达结晶的普适方法，培养一批膜蛋白结构生物学人才，促进中国结构生物学在膜蛋白结构与功能领域进入世界领先水平。五年目标：1. 摸索超量表达重组真核生物膜蛋白的体系，包括CHO细胞表达体系、昆虫细胞表达体系、酵母表达体系、细菌表达体系、体外翻译体系、植物表达体系等等，力求摸索出可以稳定大量表达各类真核生物膜蛋白并且完全保留生物活性的性价比最高的生物表达系统；2. 探索膜蛋白结晶条件的规律以及更适合膜蛋白结晶的沉淀剂、添加物；3. 解析-Secretase及类似膜蛋白酶的原子分辨率的结构，阐述其工作机理；4. 解析胆固醇代谢通路上重要的膜蛋白及其复合物的结构2-4个，揭示胆固醇代谢通路调控机理；5. 探索盒式突变技术和融合蛋白技术在GPCR结构生物学研究中的可行性，解析出1-2个多巴胺受体或其它膜蛋白的晶体结构。6. 解析肺炎链球菌具有免疫原性的膜表面蛋白及其与宿主受体蛋白的复合物的精细三维结构，并表达、纯化、结晶和结构解析重要的跨膜转运蛋白。7. 发表国际一流杂志论文（影响因子10以上）20篇以上，其中Cell、Nature、 Science论文5篇以上；培养一批膜蛋白结构生物学人才；使中国的膜蛋白结构生物学研究居于世界领先水平。8. 在结构生物学领域造就一支高水平的科研队伍，培养一批杰出的博士研究生（4060名）、硕士研究生（10名左右）和博士后研究人员（10-20名）。三、研究方案1学术思路本项目的中心学术思想是发挥我国的人才资源优势，结合强有力的财政支持，集中力量攻克有重大科学意义、备受关注的膜蛋白-Secretase，与心血管疾病相关的胆固醇代谢通路上的一系列起调控作用的重要膜蛋白，几个GPCR蛋白的结构，以及致病微生物表面膜蛋白的结构。本项目所有4个课题的核心都是膜蛋白结构与功能的研究，彼此研究方向及方法互补。这些课题都是当今生命科学领域迫切希望看到的重要结构，任何一个结构的成功解析都将在国际生命科学界上引起巨大反响。参与本项目的清华大学、中国科学院生物物理所以及中国科学技术大学是我国结构生物学的研究中心。三个机构发挥各自优势，重点突破，同时又经常交流工作思路、经验教训，促进我国结构生物学的进步，尽快使我国的结构生物学研究达到世界领先水平，并培养出一批膜蛋白结构与功能研究的杰出人才。2技术路线本项目以X-射线衍射晶体学为主、以计算生物学、NMR技术为辅，选择重点膜蛋白重组表达纯化进行结构生物学研究。在实验技术路线方面有以下几个特点及攻关重点：1） 真核膜蛋白的重组超量表达：已知结构的真核生物膜蛋白绝大多数是体内蛋白（内源性蛋白）直接纯化结晶而来，这就大大限制了研究对象的选择范围。因此真核生物膜蛋白研究领域的一个重要攻关课题是如何构建合适的表达体系，将真核生物膜蛋白重组超量表达。迄今为止，真核生物中只有不足十个膜蛋白的结构来源于重组方法获得的蛋白，有趣的是，这些膜蛋白使用了三种不同的表达体系：a.昆虫细胞杆状病毒表达体系：GPCR（b-AR2）和ASIC就是从Sf-9昆虫细胞中超量表达而来。b.酵母表达体系：哺乳动物钾离子通道是第一个报道的由重组方法获得蛋白解析结构的真核生物膜蛋白，从Pichia pastoris中表达；LTC4合成酶则由两个研究组分别从Pichia pastoris以及Shizosaccharomyces pombe中表达。c.细菌表达体系：FLAP是唯一已知的由细菌表达的解出结构的人类膜蛋白。以上信息为我们重组超量表达蛋白提供了借鉴；除了构建尝试以上系统，我们还将尝试哺乳细胞表达系统、植物表达系统和体外转录翻译系统以期寻找最好的真核膜蛋白的重组表达系统，并为整个膜蛋白结构生物学领域提供新型表达系统。2） 真核膜蛋白纯化过程中最适去垢剂及磷脂添加剂的选择：膜蛋白纯化结晶最关键的因素是去垢剂的选择。我们需要筛选大量的去垢剂以寻找最佳组合，并探索适合膜蛋白的磷脂添加剂。近年来，国际上开始出现一种同时使用多种去污剂以利膜蛋白结晶的方法，并有实验室尝试多种去污剂与磷脂添加剂混合使用；我们会系统研究如何合理选择不同的去污剂及磷脂添加剂以达到最佳效果。3） 适合真核膜蛋白的结晶方法：迄今已知的膜蛋白结晶方法除了普通蛋白常用的悬滴法、坐滴法，还有一类专门适用于膜蛋白的Lipidic Cubic Phase结晶法，GPCR即是以这种方法结晶而来。我们不仅要尝试以上几种结晶方法，总结出行之有效的规律，还计划积极尝试新方法，争取探索出新型的适合膜蛋白的结晶方法，取得方法学上的突破。4） 计算生物学与实验生物学相结合：计算生物学在膜蛋白结构生物学上的应用目前还非常有限，但前景极为广阔。根据可溶蛋白结构生物学的发展趋势，我们预见对于膜蛋白结构的预测也将成为计算生物学的一个重点及热点方向。在本项目中，我们要将计算生物学与实验生物学有机结合，通过计算生物学预测可突变、可删除及可融合位点为实验生物学提供方向；通过实验生物学为计算生物学提供模型、验证。四、年度计划研究内容预期目标第一年克隆目标蛋白，建立目标蛋白超量表达系统及纯化步骤。1. 各个课题组成功克隆出各自目标蛋白2. 在E.coli细菌超量表达系统、昆虫细胞表达系统、酵母表达系统的基础上摸索新型适合膜蛋白的表达体系3. 探索膜蛋白纯化的有效去污剂4. 初步建立有效纯化系统。5. -Secretase膜蛋白复合体超量表达体系的建立。6. 克隆表达5-10种GPCR家族膜蛋白的表达7. 解析肺炎链球菌表面蛋白中1-2个胆碱结合蛋白的三维结构第二年集中优化目标膜蛋白的纯化步骤，并尝试结晶实验。1. 优化膜蛋白纯化系统，确立各个课题目标蛋白的最佳纯化步骤2. 选择最适去垢剂及磷脂添加剂纯化-Secretase膜蛋白复合体，获取晶体，摸索-Secretase膜蛋白复合体活性测试系统。3. 建立胆固醇代谢通路中的重要膜蛋白SCAP，INSIG， SERBP及S