2.基因与基因工程.ppt

生物技术专业核心课程 基因工程 淮阴师范学院杨文杰 F基因工程及主要内容 D基因的类型 A基因研究的发展 B基因的现代概念 2 基因与基因工程 C基因的结构 E基因的表达 基因工程的创立与发展与基因的研究之间的内在联系 基因的研究为基因工程的创立奠定了坚实的理论基础 基因工程的诞生是基因研究发展的必然结果 基因工程技术的发展与应用 又深刻并有力地影响着基因的研究 使我们对基因本质的认识提高到了一个空前的高度 1 1基因研究的发展 基因的发展大体可划分为三个阶段 基因的染色体遗传学阶段 细胞遗传学 20世纪50年代之前 主要从细胞染色体水平上进行研究 基因的分子生物学阶段 分子遗传学 20世纪50年代之后 主要从DNA水平上进行研究 基因工程学阶段 分子生物技术 20世纪70年代 重组DNA技术的建立 使基因的研究进入了反向生物学研究阶段 1 基因学说的创立 遗传因子 hereditaryfactor 的提出 G Mendel 1865 基因 gene 的提出 1909年 丹麦生物学家W Johannsen根据希腊文 给予生命 之义 创造了基因一词 取代了遗传因子 染色体理论 chromosomaltheoryofinheritace 的创立 1910年 美国著名遗传学家T H Morgan及其助手Bridges Muller等 根据果蝇的遗传学实验结果提出的 第一次将代表某一特定性状的基因 同某一特定的染色体联系起来 尽管基因学说得到了普遍的承认 但是关于基因的本质的争论却一直在进行 基因的物质内容和结构特征 位于细胞核中的基因如何控制发生在细胞质中的生化过程 在细胞分裂中 基因是如何准确地复制自己的 2 基因与DNA 肺炎双球菌转化实验 1944年 美国著名微生物学家O T Avery 噬菌体的侵染与繁殖 1952年 美国冷泉港卡内基遗传学实验室的科学家Hershey等 DNA的化学本质 1928年Griffith实验 肺炎双球菌转化实验 1944年 Avery重复了细菌转化试验 噬菌体的侵染与繁殖 Hershey等1952 32P标记T2噬菌体的DNA DNA中无S 35S标记T2噬菌体的Pr Pr中无P DNA双螺旋结构模型的创立 1953年 美国科学家J WatsonandF Crick 瓦特森 克里克研究小组 主要基于Chargaff Pauling和Wilkins等三方研究成果 Watson和Crick于1953年提出了他们的DNA双螺旋结构模型 现在人们公认这是分子遗传学建立的标志 为此Watson Crick和Wilkins于1962年获得了诺贝尔生理学及医学奖 威尔金斯 富兰克琳研究小组 主要工作 Wilkins和Franklin改进了DNA分子晶体X射线衍射图谱技术 于1951年获得了更为清晰的图像结果表明 碱基位于螺旋内侧而磷酸基团在外侧 同时测得了DNA螺旋的直径和螺距 aboutFranklin 脱氧核糖核酸DNA 核糖核酸RNA 遗传的主要物质基础 RNA 核糖体RNA 信使RNA 转运RNA rRNA 与蛋白质结合组成核糖体 tRNA 合成蛋白质时的氨基酸携带者 核酸 负责遗传信息的表达参与合成蛋白质 mRNA 蛋白质合成的模板 5 磷酸核苷酸的基本结构 N A G C U T 碱基 核苷 核苷酸的概念和关系 Nitrogenousbase Pentosesugar Phosphate 基本碱基结构和命名 嘌呤 嘧啶 Adenine A Guanine G Cytosine C Uracil U Thymine T 腺嘌呤核苷酸 AMP Adenosinemonophosphate 脱氧腺嘌呤核苷酸 dAMP Deoxyadenosinemonophosphate H OH 腺苷酸及其多磷酸化合物 常见 脱氧 核苷酸的结构和命名 鸟嘌呤核苷酸 GMP 尿嘧啶核苷酸 UMP 胞嘧啶核苷酸 CMP 腺嘌呤核苷酸 AMP 脱氧腺嘌呤核苷酸 dAMP 脱氧鸟嘌呤核苷酸 dGMP 脱氧胞嘧啶核苷酸 dCMP 脱氧胸腺嘧啶核苷酸 dTMP 核酸分子中核苷酸之间的共价键 3 5 磷酸二酯键 DNA的分子结构 DNA分子中各脱氧核苷酸之间以3 5 磷酸二酯键连接 不同的DNA分子具有不同的核苷酸排列顺序 因此携带有不同的遗传信息 5 3 DNA分子是脱氧核苷酸的多聚体 DNA碱基组成特点和规律 不同物种间DNA碱基组成一般是不同的 一个给定物种的DNA碱基组成不因个体的年龄 营养状态和环境改变而改变 DNA碱基组成的Chargaff定律 腺嘌呤和胸腺嘧啶的摩尔数相等 即 A T 鸟嘌呤和胞腺嘧啶的摩尔数也相等 即 G C 嘌呤的总数等于嘧啶的总数 即 A G C T DNA的双螺旋结构 Watson Crick模型 小沟 大沟 DNA双螺旋构象的类型 DNA的双螺旋结构模型的意义 它揭示了DNA作为遗传物质的稳定性特征 碱基配对 双链互补 反向平行 这是DNA复制 转录和反转录的分子基础 亦是遗传信息传递和表达的分子基础 该模型的提出是生命科学的重大突破之一 它奠定了遗传学 生物化学和分子生物学乃至整个生命科学飞速发展的基石 DNA复制的一般特点 1 半保留复制2 固定的起点和方向3 半不连续4 需要RNA作为引物5 需要模板 DNA的半保留复制实验依据 1958年Meselson stahl用同位素示踪标记加密度梯度离心技术实验 证明了DNA是采取半保留的方式进行复制 原始分子 第一子代 第二子代 Cairns为DNA半保留复制提供的证据 1963年 Cairns将3H 胸苷标记大肠杆菌DNA 经过近两代的时间 3H 胸苷掺入大肠杆菌DNA 用溶菌酶把细胞壁消化掉 使完整的大肠杆菌染色体DNA释放出来 放射自显影 得到上图 非复制部分 C 银粒子密度较低 由一股放射性链和一股非放射性链构成 已复制部分站整个染色体的三分之二 其中一条双链 B 仅有一股链是标记的 另外一股双链 A 的两股链都是标记的 银粒子密度为前二者的两倍 染色体全长约为1100微米 复制中的大肠杆菌染色体放射自显影图 原核细胞DNA的半不连续复制复制过程 复制的起始 DNA链的延长 DNA链终止 复制叉的移动方向 3 5 3 5 DNA的复制 复制的起点 方向与速度 大多数生物体内DNA的复制都是从固定的起始点以双向等速复制方式进行的 复制叉以DNA分子上某一特定顺序为起点 向两个方向等速生长前进 复制子 replicon 基因组能独立进行复制的单位 原核生物只有一个起始点 为单复制子 而真核生物具有多个复制起点 为多复制子 起点 复制叉1 复制叉2 复制叉1 复制叉2 复制起始时复制叉移动所形成的复制眼 DNA的复制 复制的起点 方向与速度 大肠杆菌复制的起点和终止点在基因图谱上的位置 起点 终点 真核细胞基因组具有多个复制起点 DNA的复制 复制的几种主要方式 线形DNA双链的复制 DNA的复制 复制的几种主要方式 环状DNA复制时所形成的 结构 环状DNA复制时所形成的滚环式结构 D 环型复制 是指双螺旋之间氢键断裂 双螺旋解开 形成单链无规则线团 因而发生性质改变 如粘度下降 沉降速度增加 浮力上升 紫外吸收增加等 称为DNA变性 增色效应 hyperchromiceffect 由于DNA在260nm处有最大吸收值 因此 可利用DNA变性后波长260nm处紫外吸收的变化追踪变性过程 在DNA双螺旋结构模型中碱基藏于内侧 变性时由于双螺旋解开 于是碱基外露 260nm紫外吸收值因而增加 这一现象称为增色效应 熔解温度 meltingtemperature Tm 通常把DNA分子双螺旋结构失去一半时的温度称为熔点或熔解温度 meltingtemperature Tm DNA的Tm一般在70 85 之间 1 DNA的均一性 均一性高的DNA Tm值的范围越窄 DNA的Tm值与以下因素有关 2 溶剂的性质 离子强度较低的介质中 DNA的Tm值较低 熔解温度的范围也较窄 因此 DNA制剂不应保存在离子强度过低的溶液中 一般保存在1MNaCl溶液中较稳定 3 G C含量 G C含量越高 Tm值越高 复性 renaturation 变性DNA在适当条件 二条彼此分开的互补链重新结合 恢复原来的双螺旋结构 这一过程称为复性或退火 reannealing 杂交 hybridization 当DNA复性时 来源不同的DNA 或RNA 片段 按碱基互补关系形成杂交双链分子 复性在基因工程中的应用 显示不同生物体间的遗传相关性 检测特定的DNA 考查某些序列在特定生物体DNA中的拷贝数 确定特定碱基序列在DNA中的位置 分离克隆基因 Southernbloting 3 基因与DNA的多核苷酸区段 经典的基因概念 在染色体或DNA分子上 基因是成串珠似的一个挨一个地排列着 它们之间是由非遗传的物质连接起来 交换只是在基因之间进行 而不是在基因内部发生 基因的三位一体论 遗传功能单位 交换单位 突变单位 顺反子概念的提出 1955年 Benzer通过对噬菌体的研究提出了顺反子 cistron 概念 顺反子 cistron 编码一种完整多肽链的核苷酸序列 这种多肽既可以是一种具有生物活性的蛋白质 也可同别的多肽聚合形成多功能的蛋白质 顺反子是功能单位 其最小交换单位 又称交换子 和最小突变单位 又称突变子 都应是DNA分子中的一个核苷酸对 顺反子概念表明 基因不是最小的单位 它仍然是可分的 并非所有的DNA序列都是基因 而只有其中某一特定的多核苷酸区段才是基因的编码区 1902 1908年间 A Garrod在研究人类黑尿病时就已经指出 此病是由于缺乏某种酶促反应造成的 4 基因与多肽链 一种基因一种酶 1941年 G W BeadleandE L Tatum在研究红色面包霉时第一次明确提出 一种基因一种酶 的假说 1957年 V Ingram在对镰刀形细胞贫血症的血红蛋白的研究进一步证实了这一假说 一种基因一种多肽链 同型多体蛋白质 homomultimer 各种亚基相同的多体蛋白质 是由一种基因编码的 因此 一种基因一种酶 这一理论便被修正为 一种基因一种多肽链 Onegene OnepolypeptideChain 异型多体蛋白质 heteromultimer 由不同的亚基构成的多体蛋白质 是由多种基因编码的 5 基因与蛋白质的数量 并不是所有基因的最终编码产物都是蛋白质 有一些基因 例如tRNA基因和rRNA基因的最终编码产物就不是蛋白质 由于基因表达过程中存在着精细而复杂的调节作用 在一个生物个体中实际表达的蛋白质总数可能要远远超过基因的数量 一般认为人类基因组共有5 104个左右的基因 而这些基因经可变剪辑却可编码多达2 106个蛋白质 2 2基因的定义 基因就是合成有功能意义的蛋白质多肽链或RNA所必需的全部核酸序列 基因的分子定义 按照这个定义 一个基因应包括 编码蛋白质多肽链或RNA的核酸序列 保证转录所必需的调控序列 5 端非翻译序列 内含子 3 端非翻译序列等所有的核酸序列 2 3基因的结构 1 基因的组成部分 基因 编码区 codingregion 非编码区 nocodingregion 启动区 promoterregion 终止区 terminator 编码区 codingregion 含有大量的遗传密码 包括起始密码子 AUG 和终止密码子 UAA UAG或UGA 以及表达子 exon 非编码区 nocodingregion 指基因分子结构中存在的对于遗传信息表达所必须的 但却不能转译成蛋白质多肽的DNA序列 5 UTR 即5 末端非转译区 3 UTR 即3 末端非转译区 Intron 即真核基因的间隔子序列 启动区 promoterregion 指位于基因5 上游的一段具有特殊功能的DNA序列区 RNA聚合酶是通过同它结合作用而启动基因的转录 终止区 terminator 位于基因3 端下游外侧与终止密码子相连的一段非编码的核苷酸短序列区 具有终止转录信号的功能 2 原核基因的结构 原核基因的范围 原核基因 Prokargoticgene 系指由原核生物如大肠杆菌基因组编码的基因 以及高等植物叶绿体基因组编码的基因 还有线粒体基因组编码的基因 都是属于原核基因 ttgaca tataat gaatccATGCTTCAA CCTATCTGTTAAGGG TAATTTCCGAGGAAAACCTCGGAAAAAA 反向回文序列 反向回文序列 终止区序列 T80A95t45A60A50T96 T82T84G78A65C54a45 原核基因的mRNA结构 原核基因的mRNA 编码区 是连续不间断的序列 转录而不转译的5 UTR 转录而不转译的3 UTR 真核基因的范围 3 真核基因的结构 真核基因 Eukaryoticgene 系指由真核细胞基因组编码的基因和感染真核细胞的DNA病毒及反转录病毒基因组编码的基因均属于真核基因 1 20 70 转录区 终止区 启动区 80 ggccacaccc ggccaatct ggggcatataa ATGCTTCAACGGGCT TGTGCTATA GTCACTCAGgtaagg catataggccaa ctgcagTAGCAGCTG AATAAA 内含子剪接点 内含子剪接点 内含子 真核基因的结构 加尾信号 真核基因的mRNA结构 真核基因的mRNA 5 端帽的结构 5 UTR 3 端poly A 尾巴 编码区 3 UTR m7G5 ppp NmpNp AUGCTT CAACGGUAA AAUAAA AAAAAA 5 端帽的结构 3 端poly A 尾巴 2 4基因的类型 1 根据产物类型分类 结构基因 Structuralgenes 除了调节基因以外的编码任何RNA或蛋白质产物的基因 调节基因 Regulatorgenes 其产物能够控制另外一个基因或若干基因表达效率的基因 例如大肠杆菌lac操纵子的laci基因 其编码蛋白质能够控制lac操纵子结构基因的表达 2 根据表达特性 组成基因 Constitutivegenes 又叫做看家基因 Housekeepinggene 是一类理论上在所有细胞类型中都能进行表达 并为所有类型细胞生存提供必需的基本功能的基因 诱导基因 Induciblegenes 因环境中某种特殊物质的存在而被诱导表达的基因 叫做 诱导型基因 简称 诱导基因 3 根据实验用途 选择基因 Selectablegenes 是指可使被转化的细胞获得其亲本细胞所不具备的新的遗传特性 从而使得人们能够使用特定的选择性培养基 将转化的新细胞从其亲本细胞群体中选择出来的一类特殊的基因 选择基因主要是一类编码可使抗菌素 诸如氨苄青霉素 潮霉素 链霉素 卡那霉素等 或除草剂失活的蛋白酶基因 报告基因 reportergene 特指其编码产物能被快速检测 常用来判断外源基因是否已经成功地导入寄主细胞 器官或组织的一类特殊的基因 常用的报告基因有氯霉素乙酰转移酶 CAT 基因 葡萄糖醛酸糖苷酶 GUS 基因 以及绿色荧光蛋白 greenfluorescentprotein GFP 基因 3 根据结构特点 断裂基因 splitgene 编码序列不连续的间断基因 即在其核苷酸序列中间插入了与氨基酸编码无关的DNA间隔区 使一个基因分隔成若干个不连续的区段 移动基因 movablegene 又叫跳跃基因或转位因子 是指一种可以在染色体基因组上移动 甚至在不同染色体之间 噬菌体及质粒DNA之间跃迁的DNA短片段 假基因 pseudogene 指一类同野生型基因序列大部分同源 但由于突变而失去活性的畸变的核苷酸序列 重叠基因 overlappinggene 又叫嵌套基因 nestedgene 系指核苷酸编码序列彼此重叠的 编码不同蛋白质的两个或多个基因 重复基因 repeatgene 以串联方式重复排列在特定染色体上的某些多拷贝基因 如rRNA基因 tRNA基因等 2 5基因的表达 1 正义链与反义链 早期文献 正义链 有意义链 双链DNA分子中转录成RNA分子的模板链 反义链 无意义链 与有意义链互补的DNA链 现代文献 反义链 链 双链DNA分子中转录成RNA分子的模板链 正义链 链 双链DNA分子中的编码链 除了以T碱基取代U碱基之外 与RNA转录本具有同样的序列结构 2 基因的表达 基因表达 基因通过DNA的转录和RNA的翻译等过程 将其所携带的遗传信息转变成蛋白质 或RNA转录本 的过程 定义 组成性表达 constitutiveexpression 基因表达的方式 管家基因较少受环境因素影响 而是在个体各个生长阶段的大多数或几乎全部组织中持续表达 或变化很小 这类基因表达视为基本的或组成性基因表达 适应型或调节型表达 adaptiveorregulatoryexpression 有一些基因表达极易受环境变化影响而改变 称为适应型或调节型表达 在特定环境信号刺激下 相应的基因被激活 基因表达产物增加 这种基因是可诱导的 称为诱导 相反 如果基因对环境信号应答时被抑制 基因表达产物水平降低 称为阻遏 时间特异性 按功能需要 某一特定基因的表达严格按特定的时间顺序发生 这是基因表达的时间特异性 多细胞生物基因表达的时间特异性又称阶段特异性 基因表达的时间性及空间性 空间特异性 在个体生长全过程 某种基因产物在个体按不同组织空间顺序出现 这就是基因表达的空间特异性 又称细胞特异性或组织特异性 mRNA加工成熟水平上的调控 differentialprocessingofRNAtranscript 转录水平上的调控 transcriptionalregulation 翻译水平上的调控 differentialtranslationofmRNA 3 基因的表达调控 基因表达的调控水平 DNA水平上的调控 regulationonDNAlevel 翻译后水平上的调控 differentialpost translationofmRNA 反式作用因子 trans actingfactor 调控转录的各种蛋白因子总称反式作用因子 其编码基因与其识别或结合的靶核苷酸序列不