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蛋白质浓度测定方法 四种古老的经典方法 定氮法双缩尿法 Biuret法 Folin 酚试剂法 Lowry法 紫外吸收法 新的测定法 考马斯亮蓝法 Bradford法 更新的测定方法 BCA法 分光光度计的使用 原理光线的本质是电磁波的一种 有不同的波长 肉眼可见的彩色光称为可见光 波长范围在400 750nm 小于400nm的光线称为紫外光 大于750nm的光线称为红外光 当光线通过透明溶液介质时 其辐射的波长有一部分被吸收 一部分透过 因此光线射出溶液之后 部分光波减少 这种光波的吸收和透过可用于某些物质的定性定量分析 依据Lambert Beer 朗伯 比尔 定律 一束单色光通过溶液后 光波被吸收一部分 其吸收多少与溶液中溶质的浓度和溶液厚度成正比 当入射光 吸收系数K和溶液的光径长度L不变时 吸光度A与溶液的浓度C成正比 具体测量时 补充知识 型可见分光光度计 紫外分光光度计 微量凯氏 Kjeldahl 定氮法 原理 样品与浓硫酸共热 含氮有机物即分解产生氨 消化 氨又与硫酸作用 变成硫酸氨 经强碱碱化使之分解放出氨 借蒸汽将氨蒸至酸液中 根据此酸液被中和的程度可计算得样品之氮含量 以甘氨酸为例 其反应式如下 NH2CH2COOH 3H2SO4 2CO2 3SO2 4H2O NH3 1 2NH3 H2SO4 NH4 2SO4 2 NH4 2SO4 2NaOH 2H2O Na2SO4 2NH3 3 反应 1 2 在凯氏瓶内完成 反应 3 在凯氏蒸馏装置中进行 为了加速消化 可以加入CuSO4作催化剂 K2SO4以提高溶液的沸点 收集氨可用硼酸溶液 滴定则用强酸 器材1 100ml凯氏烧瓶2 改进型凯氏定氮仪3 50ml容量瓶4 分析天平 电子天平 5 烘箱6 电炉7 酒精灯8 小玻璃珠9 滴定管10 洗瓶11 锥形瓶12 铁架台 试剂1 消化液 30 H2O2 浓H2SO4 H2O 3 2 12 30 NaOH溶液3 2 H3BO3溶液4 混合催化剂 粉末K2SO4 CuSO4混合物 K2SO4与CuSO4以3 1比例充分研细混匀 5 0 01mol L标准盐酸溶液6 混合指示剂 田氏指氏剂 取0 1 甲烯蓝 无水乙醇溶液50ml 0 1 甲基红 无水乙醇溶液200ml 混合 贮于棕色瓶中备用 该指示剂酸性时为紫红色 碱性时为绿色 变色范围很窄 pH5 2 5 6 且很灵敏 7 蒸馏水 若测定的样品含氮部分只是蛋白质 则样品中蛋白质含量 总氮量 6 25若样品中除有蛋白质外 尚含有其他含氮物质 则需向样品中加入三氯乙酸 然后测定未加三氯乙酸的样品及加入三氯乙酸后样品上清液中的含氮量 得出非蛋白氮及总氮量 从而计算出蛋白氮 再进一步算出蛋白质含量 蛋白氮 总氮 非蛋白氮蛋白质含量 g 蛋白氮 6 25 双缩脲法 双缩脲 双缩脲反应 碱性环境 H2OO CC OHNNHR CHCH RO CCuC OHNNHR CHCH RH2O紫色络合物 2020 3 16 19 可编辑 原理双缩脲法是利用蛋白质的双缩脲反应而测定蛋白质含量的方法 因蛋白质含有两个以上的肽键 所以有双缩脲反应 在碱性溶液中蛋白质与Cu2 形成紫红色络合物 其颜色的深浅与蛋白质的浓度成正比 而与蛋白质的分子量及氨基酸成分无关 在一定的实验条件下 未知样品溶液与标准蛋白质溶液同时反应 并于540 560nm测定 即可以通过标准蛋白质的标准曲线求出未知样品的蛋白质浓度 试剂 一试剂1 标准酪蛋白溶液 5mg ml 用0 05mol LNaOH溶液配制 5g酪蛋白加0 05mol LNaOH溶液至1000ml 2 双缩脲试剂溶解1 5g硫酸铜 CuSO4 5H2O 和6 0g酒石酸钾钠 NaKC4H4O6 4H2O 于500ml蒸馏水中 在搅拌下加入10 NaOH溶液300ml 用蒸馏水稀释到1升 贮存在内壁涂有石蜡的瓶中 可长期保存 3 未知蛋白质溶液 球蛋白溶液 Folin 酚试剂法 Lowry法 蛋白质在碱性溶液中其肽键与Cu2 螯合 形成蛋白质一铜复合物 此复合物使酚试剂的磷钼酸还原 产生蓝色化合物 在一定条件下 利用蓝色深浅与蛋白质浓度的线性关系作标准曲线并测定样品中蛋白质的浓度 该化合物在750nm有最大吸收峰 试剂 一 1 4 碳酸钠 2 0 2N氢氧化钠 3 1 硫酸铜 4 2 酒石酸钾钠 1和2等体积混合 3和4等体积混合 然后将两液以50 1混合 甲 当天使用 二 1NFolin 酚试剂 乙 方法 标准曲线 试管中加0 0 2 0 40 0 60 1 00毫升酪蛋白溶液 500微克 毫升 加水补足1毫升 平行做两份 按序各加5毫升试剂 甲 摇匀 室温置放10分钟 再依次加入1N 0 5毫升 Folin 酚试剂 乙 摇匀 30摄氏度保温30分钟 然后在分光光度机上比色测定 A750 考马斯亮蓝染色法测定蛋白质浓度 考马斯亮蓝在一定蛋白质浓度范围内 蛋白质和染料结合符合比尔定律 因此可以通过测定染料在595nm处光吸收的增加量得到与其结合的蛋白质量 该法简单 迅速 干扰物质少 灵敏度高 比Lowry法灵敏4倍 CoomassieDye Based蛋白质定量 总蛋白定量分析 BCA Bicinchoninicacid 二辛可宁酸 二羧基二喹啉 准确灵敏 BCA试剂的蛋白质测定范围是20 2000 g ml MicroBCA试剂测定范围是0 5 20 g ml 快速 45分钟内完成测定 比经典的Lowry法快4倍而且更加方便 经济实用 除试管外 测定可在微孔板中进行 大大节约样品和试剂用量 不受样品中离子型和非离子型去污剂影响 检测不同蛋白质分子的变异系数小于考马斯亮蓝 基本原理 碱性条件下 蛋白将Cu2 还原为Cu Cu 与BCA试剂形成紫颜色的络合物 测定其在562nm处的吸收值 并与标准曲线对比 即可计算待测蛋白的浓度 蛋白质分子中 酪氨酸 苯丙氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键 使蛋白质具有吸收紫外光的性质 吸收高峰在280nm处 其吸光度 即光密度值 与蛋白质含量成正比 此外 蛋白质溶液在238nm的光吸收值与肽键含量成正比 利用一定波长下 蛋白质溶液的光吸收值与蛋白质浓度的正比关系 可以进行蛋白质含量的测定 紫外吸收法测蛋白质含量 三 操作步骤1 取15支试管 按下表编号 加试剂 2 各管混匀后 加入双缩脲试剂3 0mL 37oC反应30min 3 以0号管调零 测定各管540nm光吸收值 四 结果处理1 绘制标准曲线以牛血清白蛋白含量为横坐标 OD540为纵坐标 绘制标准曲线 2 样品的计算根据样品的OD540从标准曲线上查得样品的蛋白质含量 mg 再根据样品的体积计算出样品的浓度 五 注意事项1 须于显色后30min内测定 且各管由显色到比色时间应尽