云南省马铃薯青枯病抗性鉴定技术规程编制说明2018征求意见稿.doc

云南省马铃薯青枯病抗性鉴定技术规程编制说明2018征求意见稿 一、工作简况（一）任务xx年12月，云南省农业科学院经济作物研究所申请了马铃薯青枯病抗性鉴定技术规程地方标准的立项，云南省质量技术监督局将其列入xx年度云南省地方标准制订项目计划，批准由云南省农业科学院经济作物研究所负责牵头马铃薯青枯病抗性鉴定技术规程地方标准的制定。 （二）起草单位、协作单位起草单位云南省农业科学院经济作物研究所协作单位中国农业科学院植物保护研究所（三）主要起草人主要起草人及任务分工见表1。 表表1主要起草人及任务分工姓名性别职务/职称工作单位任务分工潘哲超男副研究员云南省农业科学院经济作物研究所项目负责人、统筹协调徐进男副研究员中国农业科学院植物保护研究所病情调查标准及抗性评价标准划分隋启君男研究员云南省农业科学院经济作物研究所云南马铃薯青枯病发生情况调查冯洁女研究员中国农业科学院植物保护研究所云南马铃薯青枯菌主要菌系分析王颖女助理研究员云南省农业科学院经济作物研究所抗性鉴定试验验证卢丽丽女助理研究员云南省农业科学院经济作物研究所菌种分离、鉴定、保存续表11姓名性别职务/职称工作单位任务分工杨琼芬女研究员云南省农业科学院经济作物研究所资料收集与意见征集李先平男研究员云南省农业科学院经济作物研究所病圃的建立白建明男研究员云南省农业科学院经济作物研究所参试马铃薯品种选择包丽仙女副研究员云南省农业科学院经济作物研究所基质配比的确定 二、制定标准的必要性和意义由茄科雷尔氏菌（Ralstoniasolanacearum(Smith)Yabuuchi etal.，简称青枯菌）引起的马铃薯青枯病（Bacterial wiltof potato，也称褐腐病Potato brownrot）是世界范围内马铃薯生产上仅次于晚疫病的第二大病害。 马铃薯植株一旦罹患青枯病，短时间内即表现出快速萎蔫枯死症状，基本丧失产量或经济价值。 青枯病在全球范围内影响了近80个国家的150余万公顷的马铃薯生产，每年造成的产量损失超过9.5亿美元。 引起马铃薯青枯病的青枯菌3号生理小种/生化变种II（r3/bv2）菌株被美国农业部、欧洲和地中海植物保护组分别列为农业生物恐怖因子和A2类检疫对象；此外，亚太地区植物保护组织和泛非植物检疫理事会也将其列为重要进出境检疫对象。 上世纪70年代，马铃薯青枯病仅偶见于湖南及四川山区，但随后由于马铃薯栽培品种不断更替，异地引种、调种以及环境条件等因素的影响，马铃薯青枯病在我国迅速传播蔓延至10余个省份，并成为影响马铃薯生产发展的重大障碍。 据华静月等报道，该病在我国中原和南方马铃薯二季栽培地区以及西南 一、二季混作区普遍发生，危害严重。 四川省彭县调查，1980年通济区因青枯病危害当年损失种薯1000万kg，有的田块绝收；1981年，峨嵋县损失一级脱毒原种5万余公斤，1984年什邡县山区因青枯病危害严重直接影响了群众种植马铃薯的积极性。 1988年成都部分田块损失材料达50%。 90年代以来，随着马铃薯种薯质量的提高及各地区的综合防治，马铃薯青枯病得到了一定程度的控制，但仍旧是南方马铃薯生产的常见问题，作为马铃薯的主要种植区域，西南地区的马铃薯种植面积将近4000万亩（占全国总面积的41%），青枯病在四川、云南、贵州等地时有发生。 云南作为马铃薯主产省份，在栽培区划上属于西南单、双季混作区，气候立体多样，周年生产的模式使种薯调运频繁，大春地区受青枯菌潜伏侵染的薯块，随种薯调运传播至其它地区，加之部分地区粗放的耕作制度以及缺乏有效的种薯检疫措施等原因，使马铃薯青枯病在我省分布广泛，危害日趋严重，成为我省马铃薯产业可持续健康发展的重要限制因素。 xx、xx项目组连续两年对云南省德宏州冬作马铃薯青枯病进行调研，调研人员实地走访了德宏州主要青枯病爆发区域(芒市、盈江)，对病害发生情况进行了调查，发病率10%左右，从出苗到收获陆续发病，对产量的影响也在10%左右。 马铃薯青枯病尚无经济有效的药剂防治手段，选育抗性品种是防控该病最有效的措施之一，但现有马铃薯育种工作中极少开展青枯病抗性鉴定，马铃薯新品种选育过程中缺乏青枯病抗性鉴定环节，或存在抗病性鉴定方法不完善、技术不规范等问题，亟需建立一套完善的马铃薯品种青枯病抗性的评价方法和指标。 目前，国内尚无马铃薯青枯病品种抗性鉴定标准，本项目拟通过马铃薯青枯病抗性鉴定技术规程的制定，规范马铃薯品种的青枯病抗性评价体系，填补马铃薯青枯病抗性鉴定的空白，为云南省马铃薯新品种抗病性鉴定标准化和规范化提供技术保障。 这对于加速我省马铃薯新品种选育以及新品种的推广应用、确保我省马铃薯产业健康可持续发展、推动农业产业技术全面升级具有十分重要的意义。 三、主要起草过程（一）成立项目组xx年云南省质量技术监督局批准由云南省农业科学院经济作物研究所负责牵头制定马铃薯青枯病抗性鉴定技术规程地方标准。 任务下达后，云南省农业科学院经济作物所联合中国农业科学院植物保护研究所成立马铃薯青枯病抗性鉴定技术规程起草小组，确定了本标准的起草单位和主要起草人员，明确了任务分工。 （二）搜集资料xx年1月开始，标准起草小组查阅、收集了包括试验数据、工作总结、研究报告、发表论文、专著等大量国内外青枯病发生规律、抗性鉴定等相关资料，以及马铃薯相关的国家标准、行业标准和地方标准。 根据起草单位多年开展马铃薯青枯病抗性鉴定的试验结果，进行分析总结，确定了标准编制的技术内容。 （三）形成征求意见稿xx年7月，综合起草小组基于文献查询资料及多年来对马铃薯青枯病抗性鉴定研究技术的积累，形成了标准初稿，经项目组讨论、修改后形成马铃薯青枯病抗性鉴定技术规程标准征求意见稿。 广泛征集了国内马铃薯相关领域科研、教学和推广单位对标准征求意见稿的修改意见和建议。 对征集反馈的专家意见进行认真梳理修改，根据的专家提出的意见，标准起草单位决定对标准的部分技术指标、参数进行进一步的优化完善。 （四）标准的主要技术指标、参数优化xx年xx年，通过试验论证，标准起草小组对青枯病抗性鉴定标准的主要技术指标、参数进行了优化及确定。 首先对近年来于云南省分离获得的马铃薯青枯病菌株进行了系统分类鉴定，明确了以省内马铃薯青枯病优势菌系3号小种为接种体，优化了马铃薯青枯病抗性鉴定操作程序，通过开展马铃薯品种抗病性鉴定预研试验，确立了感病对照品种，优化了马铃薯种植的基质配比，通过设置浓度梯度试验，确立了接种浓度，结合多次评价结果，确立了评价标准的划分等，使得鉴定标准技术流程清晰，操作简便，结果重复可信，使得本标准成熟化。 （五）形成送审稿xx年1月10月，进行各项试验数据的及分析，进一步听取了从事马铃薯育种研究、种薯生产、质量检测和推广等部门同行专家意见，对相关反馈意见进行梳理和分析，采纳专家的合理修改意见，于xx年11月对征求意见稿文本进行修改和完善，形成马铃薯青枯病抗性鉴定技术规程标准送审稿。 四、制定标准的原则和依据，与现行法律、法规、标准的关系（一）制定标准的原则1.科学性原则本标准总结了马铃薯青枯病相关研究领域的前期工作，针对马铃薯青枯病发生流行特点、侵染循环、传播途径等，科学地规定了马铃薯青枯病抗性鉴定的鉴定方法、分级标准和抗性评价等要求。 本标准所述方法已经在中国农科院植保所及云南省农科院经作所应用，标准文稿是基于多年开展马铃薯品种抗性鉴定的总结。 在标准起草中，充分考虑了云南马铃薯青枯病发生规律特点，结合马铃薯青枯病抗病育种工作实际，通过试验验证、科学分析和总结归纳，使标准充分体现其科学性。 2.适用性原则根据云南的马铃薯育种及产业技术体系需求，起草小组制定了马铃薯青枯病抗性鉴定技术规程。 本标准可以作为云南省的地方标准，适用于云南省所有马铃薯新品种以及种质资源的抗病性筛选与评价，所采用方法在有条件的科研单位和大专院校均能够开展，抗性鉴定方法经多轮试验验证，结果可靠，能实现马铃薯青枯病抗性鉴定程序的标准化，指导云南省及同类地区开展马铃薯青枯病抗性鉴定，完善马铃薯育种环节，指导抗病品种的生产布局，标准内容规范，操作简便、易掌握，具有可操作性、适用性，应用范围较广。 3.统一和协调性原则目前国内外尚无马铃薯青枯病抗性鉴定技术规程方面的国家、行业及地方标准。 本标准是云南省首次针对马铃薯青枯病抗性鉴定技术规程制定的地方标准，能与国家、行业和地方标准相互补充，符合协调性原则。 4.规范性原则本标准严格按照GB/T1.1-xx标准化工作导则第1部分标准的结构和编写给出的规则进行编写，同时参考国内外马铃薯青枯病抗性鉴定的先进技术，符合标准撰写的规范性原则。 （二）制定标准的依据本标准制定过程中依据的主要标准见表2。 表表2参照标准及依据序号标准号标准名称1GB/T1.1-xx标准化工作导则第1部分标准的结构和编写2SN/T1135马铃薯青枯病菌检疫鉴定方法3GB18133马铃薯种薯本标准与现行法律法规无冲突。 五、主要条款的说明，主要技术指标、参数、试验验证的论述（一）主要技术指标、参数本标准根据多年试验结果，结合操作实际，提出了马铃薯青枯病抗性鉴定技术，其主要技术指标和参数说明如下。 1.青枯菌菌系选择作为复合种，青枯菌根据系统进化关系、寄主范围以及生理生化代谢特征可进一步被划分为演化型、生理小种和生化变种。 xxxx年分别于云南昭通、会泽、驾车、寻甸、嵩明、团结乡、东川、轩岗、陇川等地田间采集了376份云薯 401、丽薯6号、合作88等马铃薯主栽品种的疑似青枯病样品材料。 分离出81个菌株，经鉴定均为青枯菌3号生理小种，从而探明了3号小种是云南省马铃薯青枯病的主导菌系；国外相关研究论文、区域性植物保护组织“欧洲和地中海植物保护组织（EPPO）”、“亚太地区植物组织（APPPC）”和“泛非植物检疫理事会（IAPSC）”以及美国农业部（USDA）官方文件中的马铃薯青枯菌均特指青枯菌3号小种/生化变种II菌株。 参照国内文献报道，云南的菌株，尽管存在其它生理小种，但由于当时测定方法为生理生化方法，部分检测结果可能有误，如5号生理小种为桑树青枯病，马铃薯上不应存在。 据徐进 （xx）全国青枯菌的遗传多样性分析的结果，云南的主要菌系也为3号生理小种，此外，国内外诸多相关研究证实了马铃薯3号小种是马铃薯上的专化性小种，马铃薯青枯病的优势菌系为3号小种，此外，依据国际马铃薯中心Liliam Gutarra （xx）的试验表明，3号生理小种对马铃薯的致病力远远大于其它小种，因此本标准制定选取云南省分离的马铃薯青枯病3号小种作为本标准接种用菌株。 2.接种体制备将室温下保存于灭菌去离子水中的青枯菌株在TZC平板上划线培养，30?C条件下培养48小时。 挑取典型菌落转移至NA培养平板或斜面上，30?C培养48小时。 此时为青枯菌对数生长期，接种体现配现用。 接种体的浓度影响试验发病进程，浓度过高造成发病过快致使品种间抗性差异难以评价，浓度过低则发病周期过长，不方便试验材料管理。 经多轮试验，比较了3107CFU/ml、3108CFU/ml、3109CFU/ml等系列接种浓度，接种浓度过高，致发病过快难以评判，浓度过低则需要在接种时浇入较多的菌悬液，增加操作的难度，最终确定了采用接种浓度3108CFU/ml的菌悬液作为接种体。 按照Chih-Hung Lin （xx）及Liliam Gutarra （xx）的方法，利用紫外分光光度计，设定波长为600nm，挑取菌落用灭菌水将菌悬液的OD600值调至0.3，此时的悬浮液中细菌的细胞数为3108CFU/ml。 然后按1ml10g干土的比例接种，土壤中接种体终浓度为3107CFU/g干土，接种两周后开始发病，发病时间适合，品种之间差异明显。 3.供试材料准备及对照品种选择待鉴定马铃薯品种（系）和对照品种播种的种薯级别为原原种，原原种种薯质量较高，可以排除其它病虫害干扰，且原原种种薯较小，适于采用伤根法接种。 不结薯的资源材料可经组培苗扩繁后移栽至盆钵中生长。 待鉴定马铃薯品种（系）和对照品种（系）统一种植，统一管理，保证植株生长正常、旺盛、整齐。 参照国际马铃薯中心Liliam Gutarra （xx）的方法，每个品种5株苗，3次重复，本标准为提高试验准确性，采取每个供试品种(系）接种10株，不少于3次重复，确保鉴定结果可靠，在植株1520cm高度时接种为宜，此时植株一般只有一个主茎，便于病情的观测及调查。 感病对照品种为米拉。 该品种在几轮青枯病抗性评价试验中表现最为感病，且曾为云南省的主栽品种，当前仍有一定的种植面积，适于作为本标准的试验对照。 4.基质要求土壤环境极大影响着青枯菌的存活性，一般来说，粘性土适宜青枯病的发病，综合考虑马铃薯原原种生产经验及青枯病试验的需要，同时也参考了Liliam Gutarra （xx）的方法，标准试验采用的盆栽土用珍珠岩、腐殖土、耕土按1:1:2的比例配制，使既具有适于马铃薯正常生长的条件又适于青枯病抗性评价试验。 试验用的珍珠岩、腐殖土、耕土以及各种器具如缸、盆、箱等均应进行消毒处理。 5.接种方法及条件采用伤根土壤浇菌液接种法，简称伤根土壤接种法，在离供试材料茎基一侧5cm处，用利刀或利铲插入土中515cm，以切伤部分侧根，然后从土表切缝处浇入菌液。 青枯菌在土壤中长期存活，通常可从植物根部或茎部的伤口侵入，随后进入木质部并且扩散至植物上部，通过伤根接种法造成伤口，从而使青枯菌侵染马铃薯植株，遵循青枯病的发病机制。 6.温湿度要求青枯菌适宜在温暖的环境下生存和引发病害，接种之后，应提供适于青枯病菌定殖和成功完成侵染的温、湿度条件，即温度28?C，空气相对湿度70%，土壤湿度为土壤最大持水量的60%左右，接种鉴定试验的时间一般应持续28天。 温度过低，青枯病发病较慢，且容易造成晚疫病发生等，影响抗性的判别，温度控制在28?C，有利于青枯病的发展，马铃薯茎叶也可正常生长。 空气湿度及土壤湿度的控制，主要在于青枯菌通过由根部入侵后通过维管束蒸腾作用运输，空气湿度不宜过高，否则有利于晚疫病等病害的发生，过低则导致土壤水分蒸发过快，也不利于青枯病的发生。 7.病情调查发病严重度是马铃薯植株青枯病发病程度的量化指标。 参照孙慧生主编马铃薯育种学第十章“抗青枯病育种”报道的方法，进行发病分级调查。 马铃薯青枯病最典型的症状表现为植株叶片或整株萎蔫，还可表现为叶片变黄、植株矮化、烂根、维管束变色和块茎腐烂等症状；在抗病性鉴定试验中，主要以萎蔫症状作为发病评判标准，藉此计算发病严重度，叶片变黄等其它症状仅供参考。 各品种在发病率上表现无显著差异，但在发病严重度上存在较大的抗性差异，因此按植株发病严重度确定各植株级别将无症状植株定为1级，刚开始发病即1个叶片或小叶萎蔫的植株定为2级，23个叶片萎蔫和4个以上叶片萎蔫分别定为3级和4级，全部叶片萎蔫或植株死亡的植株为5级，分级标准清晰，便于调查。 在感病对照品种发病后开始调查，每隔两天调查1次，以感病对照品种达到其相应该病程度（4.1）时作为判定的时间。 马铃薯青枯病发病分级标准如下表表 33、马铃薯青枯病发病分级标准发病严重度的分级症状表现1级无症状；2级1个叶片或小叶萎蔫；3级23个叶片萎蔫；4级4个以上叶片萎蔫；5级全部叶片萎蔫或植株死亡。 8.抗性评价划分标准抗性鉴定以计算出的病情指数数值，参照孙慧生主编马铃薯育种学第十章“抗青枯病育种”的方法，进行抗性级别划分，马铃薯还未发现完全抗性的资源品种，表现为数量抗性，根据对品种病情指数及抗性结果的统计分析，DI值1.12.5的品种资源较为抗病，划分为抗性品种，DI值2.64.0的品种表现具有一定的抗性，划分为中抗品种，而DI值2.64.0基本不具有任何抗性，划分为感病品种。 确定鉴定品种（品系）的抗病性评价标准如下表表 44、马铃薯青枯病抗性评价标准马铃薯青枯病抗性评价标准病情指数DI抗性级别抗中抗感代号RMRS1.12.5抗病R2.64.0中抗MR4.15.0感病S（二）试验验证世界各国在生产上普遍种植的是四倍体普通栽培种，生产中马铃薯青枯病抗性品种极少，只发现极少数具中等抗病性或耐病性的材料，青枯病抗性主要存在于野生种资源中，上世纪80年代以来，国际马铃薯中心利用抗性野生种资源开展了青枯病抗性育种工作，结合群体改良、轮回选择等技术，培育出了许多抗青枯病材料，这些材料在世界各地及中国进行鉴定、筛选及利用，抗青9-1（BR63.5104.12LB）是中国农科院植保所1989年从国际马铃薯中心(CIP)引进的马铃薯杂交组合实生籽后代中，1990-1993连续4年自然病圃进行抗青枯病鉴定和筛选，经10余年选育而成的高抗青枯病的新品种，含有二倍体近缘栽培种富利亚(Solarium phureja)的抗青枯病基因。 Liliam Gutarra （xx）对国际马铃薯中心抗青枯病BW群体材料进行了抗性鉴定，C 133、C 131、C 128、D 92、D 94、C 129、C132，这些已知的抗性资源及品种被用来作为本标准试验验证材料。 在对所收集资料进行分析总结的基础上，以云南省主要栽培马铃薯品种为试验材料，开展了3次以上重复的试验验证工作，进行了试验数据的分析、和汇总，确定标准参数及其内容准确，完整和有效。 根据抗病性评价标准，得到抗性鉴定结果，如下表。 表表55马铃薯品种（系）抗性鉴定结果品种（系）病情指数抗性评价结果云薯201云南省农科院经作所2.2R抗青9-1中国农科院植保所及云南省农科院经作所2.3R C133国际马铃薯中心2.4R C131国际马铃薯中心2.4R会-2会泽农技中心2.4R镇薯1号云南省农科院经作所3.0MR C128国际马铃薯中心3.2MR云薯506云南省农科院经作所3.2MR云薯401云南省农科院经作所3.4MR合作88云南省师范大学、会泽农技中心3.6MR云薯105云南省农科院经作所3.7MR D92国际马铃薯中心3.7MR宣薯2号宣威市农业技术推广中心3.8MR D94国际马铃薯中心3.9MR C129国际马铃薯中心3.9MR丽薯6号丽江市农科所3.9MR云薯107云南省农科院经作所3.9MR C132国际马铃薯中心3.9MR云薯604云南省农科院经作所4.2S云薯202云南省农科院经作所4.2S云薯603云南省农科院经作所4.3S鄂薯5号湖北省农科院4.3S云薯505云南省农科院经作所4.3S中甸红云南地方品种4.4S青薯9号青海省农林科学院4.4S云薯301云南省农科院经作所4.4S云薯902云南省农科院经作所4.8S云薯304云南省农科院经作所4.8S米拉德国引进品种4.9S试验共计鉴定了29个品种（系），其中，抗病材料有5个，分别为云薯 201、抗青9- 1、C 133、C 131、会-2；中抗材料13个，分别为镇薯1号、C 128、云薯 506、云薯 401、合作 88、云薯 105、D 92、宣薯2号、D 94、C 129、丽薯6号、云薯 107、C132；感病材料11份，为云薯 604、云薯 202、云薯 603、鄂薯5号、云薯 505、中甸红、青薯9号、云薯 301、云薯 902、云薯 304、米拉；试验结果基本与国际马铃薯中心结果一致，国际马铃薯中心BW群体材料本次试验中基本都属于抗病及中抗材料，抗性鉴定结果显示，我省抗病品种较少，仅云南省农科院经作所选育的云薯 201、中国农科院植保所及云南省农科院经作所合作选育的抗青9-1及会泽农技推广中心会-2为抗病品种。 这与生产中缺乏青枯病抗病品种，仅存在少数抗病品种的结论一致，说明本抗性鉴定方法结果可靠，可以用作抗病品种的筛选评价，此外，针对当前抗病品种缺乏的情况，可以利用国际马铃薯中心引进的资源C 133、C131，作为青枯病抗性育种的亲本材料。 六、重大分歧意见的处理依据和结果本标准共征求包括大专院校、科研院所等10家单位意见，累计共收到意见58条，采纳56条，未采纳2条，未采纳的2条意见为文本形式上的意见。 本标准