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文档简介
第五讲植物细胞培养PlantCellCulture 第一节植物细胞培养简介 一 概念 在培养基中培养彼此分离的细胞 使之生长 增殖或分化 二 类型 1 固体培养 solidculture 在固体培养基中培养细胞 静止培养 细胞被固定 不能移动 单细胞分裂后形成细胞团优缺点 1 所得到的各个细胞团均为单细胞形成 遗传成分和生理特性具有一致性 2 细胞生长速度较慢 3 不能长期 连续 大规模培养细胞 2 液体培养 liquidculture 在运动的液体培养基中培养细胞 又称悬浮细胞培养 suspensioncellculture 细胞是分散的 可以长期培养 有2种形式 成批培养 batchculture 一个容器的细胞培养结束后 细胞被转移到新的容器中继续培养 连续培养 continuousculture 在一个容器 或者系统 中连续不断的培养植物细胞 成批培养 连续培养 悬浮细胞培养的特点 1 细胞生长速度较快 2 可以长期 连续 大规模培养细胞 3 不能跟踪单细胞的分裂和生长过程 三 细胞培养的应用 1 进行细胞生物学研究 通过适当的培养技术 人们可以连续观察和记录 摄像 单个细胞的生长 分裂和分化的全过程 因此 细胞培养技术是研究细胞生长 分裂和分化的良好实验体系 如某个或某种类型的植物细胞是怎样生长 分裂和分化的 化学物质 激素等 或者物理因素 重力 压力 等是怎样影响这些过程的 细胞培养证明了植物细胞全能性 2 培育植物变异体 有变异 才会有选择人们总是希望获得具有某些抗性的品种 如抗病 抗虫 抗盐碱 抗铝 抗除草剂等 1 从自然变异的植株中进行选择 自然变异率低 机会小 工作量大 效率低 2 杂交育种 可以把抗性基因转移到需要改良的品种中 但时间长 3 诱变植物 种子或芽 工作量大 4 细胞培养 效率高 先诱变细胞 再将细胞培养在有选择压力的培养皿中 具有抗性的细胞就可以分裂 诱导其形成完整植株 即可获得抗性变异体 在一个培养皿中 一次可以筛选10 20万个细胞 一个细胞就是一潜在的植株 3 生产有用化合物 利用大规模细胞培养技术可以在室内生产一些植物细胞合成的有用物质 如色素 香料 药物成分等 第二节细胞培养的建立 维持和生长特点 一 细胞培养的建立和维持细胞培养通常是将植物材料接种在液体培养基中 经过摇荡建立起来的 外植体 液体培养 振荡 培养上清液 愈伤组织 液体培养 继代培养 振荡 建立起来的悬浮细胞必须适时进行继代培养 继代培养 传代培养 subculture 将培养物 芽 愈伤组织 细胞等 分成若干份 接种到新鲜培养基上继续增殖的过程 愈伤组织 callus 是一群无明显组织分化 有分裂能力的细胞群 团 有多种类型 在颜色 松散程度 含水量 生长速度等方面存在差异 形成的因素 创伤或 和 植物激素的诱导 分化 differentiation 形态 结构和功能相同的细胞变成形态 结构和功能互不同的细胞的过程 如分生组织细胞转变成薄壁组织 维管组织 厚壁组织等 脱分化 去分化 dedifferentiation 已分化 成熟的细胞失去原有的状态 重新恢复分裂能力的过程 外植体形成愈伤组织的过程就是脱分化的过程 再分化 redifferentiation 愈伤组织形成其它组织或器官的过程 二 悬浮细胞的生长过程 1 悬浮细胞生长的特点细胞培养周期 两次继代培养所间隔的时间 在一个细胞培养周期中 细胞的生长情况经历了慢 快 慢的过程 下图 延滞期 快速生长期 静止期 下降期 渐降期 云南红豆杉细胞生长曲线 延滞期 细胞继代培养开始后的一段增殖缓慢的时间 快速生长期 细胞数量 重量或体积直线上升的时期 对数生长期渐降期 细胞生长速度逐渐减慢的时期 静止期 新生的细胞数量与死亡的细胞数量达到动态平衡的时期 下降期 活细胞数量不可逆下降的时期 云南红豆杉细胞生长和蔗糖消耗动态 蔗糖浓度 细胞干重 细胞悬浮培养要求达到一定的接种细胞密度 cells ml 一般为0 5 2 5 105个细胞 ml 密度高 细胞分裂快 延滞期短 密度低则相反 如果密度太低 则细胞不能不分裂 最后全部死亡 因此 悬浮细胞培养时 要求达到最低起始细胞密度 minimuminitialcelldensity 最低起始细胞密度 细胞能够生长 分裂的最低接种密度 影响最低起始细胞密度的因素 1 植物种类 生长快 容易培养的植物 如大多数草本植物 其最低起始细胞密度比较低 相反 则高 2 细胞的生理状况 用快速生长期的细胞接种 则起始细胞密度可以比较低 3 培养基成分 用营养成分丰富的培养基或条件化培养基 conditionedmedium 培养细胞 起始细胞密度低 条件化培养基 培养过几天高密度细胞后的无细胞培养基 4 培养方式 采用看护培养 nurseculture 是降低最低起始细胞密度的有效方法之一 看护培养 nurseculture 将亲本愈伤组织或高密度的悬浮细胞同低密度细胞一起培养 以促进低密度细胞生长 分裂的培养方法 NurseCulture 微孔滤膜 低密度细胞 高密度细胞 透析袋 第三节单细胞培养技术 单细胞培养是培养彼此分离的单个细胞 是研究和观察细胞生长与分裂过程的有效方法 单细胞培养常用的方法 微室培养和平板培养 一 微室培养 Cultureinmicrochamber 微室培养是在悬滴培养的基础上发展而来的 1955年DeRopp把含有细胞的液体培养基滴在玻璃板上以观测单细胞的生长 但他没有发现单细胞分裂 发生分裂的是含有几个细胞的小细胞团 1957年 Torrey改进了培养方法 采用微室培养 利用此培养技术培养豌豆根尖单细胞 得到了含几个细胞的细胞团 1960年 Jones用条件化培养基在微室中进行悬滴培养烟草杂种细胞 得到了含30个细胞的细胞团 并用录象记录了细胞分裂的全过程 微室 载波片 石蜡 固体培养基和愈伤组织 单细胞 二 平板培养 Plateculture 1960年Bergamann首创 是在固体培养基中培养大量单细胞的一种方法 1 单细胞悬浮液的制备 1 用不锈钢滤网 150 m 过滤快速生长期 旺盛分裂 的悬浮细胞 得到单细胞滤液 2 滤液经过离心后 细胞沉淀 3 倒出上清液 用新鲜培养基重新悬浮细胞 并调节细胞密度 视最终接种密度和固体培养基混合的比例而定 一般5 103 5 105cell ml 步骤 细胞悬浮液与固体培养基混匀后 倒平板 2 培养基制备配制固体培养基 但浓度要比正常的高 与稀释倍数有关 高温灭菌后冷至35 40 条件化培养基的配制 培养悬浮细胞的培养液 离心 取上清液 与高温灭菌的培养基等量混合 冷至35 40 备用 3 平板培养的制作 将单细胞悬浮液按预定的比例与35 40 固体培养基混合均匀后 倒入无菌培养皿中 培养基的厚度为5mm左右 盖上盖子 摇动 布匀 用Parafilme膜封口后 进行培养 或放入垫有湿润无菌滤纸的大培养皿中 以防水分的蒸发过快 4 培养条件 温度为25 黑暗或弱光照 平板培养的效果 可用植板率 plateefficiency 来衡量 植板率 每个平板中新形成的细胞团数 每个平板中接种的细胞数 100 影响植板率的因素 1 植物种类 生长快 容易培养的植物 如大多数草本植物 其植板率高 相反 则低 2 细胞的生理状况 用快速生长期的细胞接种 则植板率高 3 接种细胞密度 接种密度高 有利于细胞分裂 提高植板率 如烟草细胞 烟草细胞接种密度和植板率 接种密度过高 会使细胞团之间相互靠近 接触 这不仅造成计数困难 而且无法判断细胞团的归属 不利于细胞系克隆 clone 的选择 4 培养基成分 用营养成分丰富的培养基或条件化培养基 植板率高 5 培养方式 采用看护培养 nurseculture 是可以提高植板率 平板培养是分离 筛选单细胞无性系的有效方法 第四节植物细胞大规模培养生产次生代谢物质 ProductionofSecondaryMetabolitesbyLarge scaleCultureofPlantCells 一 植物次生代谢和次生代谢产物 一 次生代谢和次生代谢产物初生代谢 为维持植物正常的生长发育所必须的代谢 如呼吸作用 光合作用 蛋白质和氨基酸代谢 核酸和核苷酸代谢 脂肪代谢 激素代谢等 初生代谢产物 初生代谢过程中形成的各种产物 初生代谢产物不稳定 在体内容易发生转化 次生代谢 对植物正常的生长发育非必需的代谢 其代谢产物称为次生代谢产物 次生代谢是在初生代谢基础之上衍生而来的 次生代谢产物为小分子有机化合物 其产生和分布通常有种属 器官 组织以及生长发育时期的特异性 也往往是末端代谢产物 比较稳定 可以在体内积累 植物次生代谢产物种类繁多 已经分离 鉴定的有10万个左右 按结构特点可分为苯丙素类 醌类 黄酮类 单宁类 萜类 甾体及其甙 生物碱七大类 详细情况可参阅 中药化学 天然产物化学 等书 鬼臼毒素 抗肿瘤 苯丙素类 水飞蓟素 治疗急 慢性肝炎 肝硬化 中毒性肝损伤等 的良药 苯丙素类 天然色素 绛红色 抗菌 抗炎 抗病毒 止血 用于化妆品生产 紫草 紫草根 紫草素 醌类 芦丁 槲皮素 治疗心脑血管疾病药物的主要成分 槲皮素R H芦丁R 芸香糖 银杏黄酮 大豆黄酮 预防心血管疾病 黄酮类 麻黄碱 止咳平喘 小檗碱 抗菌消炎 奎宁 抗疟疾 生物碱 来源于生物体的一类含氮有机化合物 多具有显著生物活性 罂粟 鸦片 主要产地 金三角地区 缅甸 老挝 泰国 阿富汗 巴基斯坦 南美 吗啡 镇痛作用 鸦片 含丰富的吗啡 可待因等生物碱 药物 镇痛毒品 麻痹 毒害神经 破坏免役力 容易成瘾海洛因 由吗啡合成的二乙酰吗啡 长春花 ajmalicine阿吗碱 2000 kgVinblastine长春碱 2million kgVincristine长春新碱 15million kg 阿吗碱 长春碱 长春新碱 紫杉醇 Paclitaxel Taxol 紫杉醇的发现 50年代末 60年代初 癌症病人大量增加60年代中期 美国食品与药物管理局 FDA 制定计划 广泛寻找 筛选治疗癌症的药物 动物 植物 微生物 1969 美国农业部 USDA 采样员在Oregon洲采取到太平洋紫杉 pacificyew 短叶红豆杉 树皮 后经筛选试验发现有强烈的抑制肿瘤的作用 红豆杉 Taxus 明星植物 药物黄金 JournalofAmericanChemistrySociety1971May5 93 9 2325 23257 Plantantitumoragents VI Theisolationandstructureoftaxol anovelantileukemicandantitumoragentfromTaxusbrevifolia WaniMC TaylorHL WallME CoggonP McPhailAT 1971年 美国北卡州的三角化学研究所的化学家成功地分离出活性物质 起名紫杉醇 并发表了它的化学结构 没有申请专利保护 1970 S 紫杉醇有很好的治疗癌症但临床实验导致1人死亡 FDA否定了紫杉醇1979 爱因斯坦医学院博士后Susan在Science上发表了紫杉醇抗肿瘤机理 重新激起人们对紫杉醇的兴趣 1980 S 发现了导致病人死亡的原因 并解决了紫杉醇安全制剂 广泛研究紫杉醇抗肿瘤作用 发现对多种癌症有效 对耐药性卵巢癌和乳腺癌有特效 且毒副作用远远小于当时发现的其它抗癌物质 1992年 FDA正式批准紫杉醇为临床用药 我国在中国医学科学研北京药物研究所方启程研究员主持下 开展了以我国红豆杉为原料的紫杉醇药物生产 成功研制了国产紫杉醇针剂 紫素 1600元 支 导致进口针剂降到1900元 支 紫杉醇 4000 6000元 g 进口针剂2980元 支 30mg紫杉醇 紫杉醇为什么贵 不仅是因为有特效 临床有效率 40 更主要是因为资源稀缺 红豆杉种类 全世界11种 北半球 我国4种一变种 东北红豆杉 中国红豆杉 云南红豆杉 喜马拉雅红豆杉 西藏红豆杉 南方红豆杉 中国红豆杉的变种 数量少 稀少 散生 不成林紫杉醇含量低 干树皮中0 01 万分之一 生长缓慢 小苗需要生长50 70年才可成树 提取紫杉醇 树剥皮即死 红豆杉资源 1999年 红豆杉被列为我国一级保护植物2000年后 云南汉德生物技术有限公司非法提取 出口紫杉醇 使野生云南红豆杉遭到毁灭性破坏农民卖树皮1元 公斤 商贩5元 公斤卖给丽江汉德公司 丽江汉德公司生产半成品 氯仿提取物 1900元 公斤供应给云南汉德 云南汉德生产紫杉醇 20万美元 公斤卖给国外公司 100公斤树皮能生产1公斤半成品 100公斤半成品可生产1公斤紫杉醇 1万kg树皮 1kg紫杉醇 1万元增殖150万元 被剥皮的云南红豆杉 二 获得次生代谢物的方法 植物次生代谢产物的重要性 色素 香料 药物与保健品 食品添加剂 化工等重要原料等 全球2 3的药物直接或者间接来源于植物次生代谢产物 天然产物 天然药物 1 从植物中提取 可靠 但受到资源的限制 会破坏野生资源 人工栽培则占用土地 受病虫害 自然灾害等因素的限制 2 化学合成 产量高 成本低 但污染环境 而且有些物质结构复杂 难以人工合成 如海南粗榧内酯 有些虽然可以人工合成 但成本太高 如紫杉醇等 尚未合成 成本太高合成 3 植物细胞大规模培养 植物细胞具有形态全能性 化学全能性 在离体条件下可以合成整株植物能合成的物质 优点 不破坏 不依赖野生资源 不受环境因素的影响 环境污染小 不占用土地资源 产量可以调控等 所以是一种很有前途的方法 自1956年Routin和Nickell首次提出植物细胞培养技术生产天然产物的专利以来 人们在这方面做了大量的探索 取得了重要进展 主要成就 证明植物细胞在离体条件下可以合成次生代谢物质 发现了提高细胞次生代谢物质含量的方法 可以对植物细胞进行大规模培养 75吨 成功商业生产了少数次生代谢物质 2020 3 16 63 可编辑 1974年 德国Reihard等在药用植物 希腊毛地黄 细胞培养方面取得重要进展 成功地进行了治疗心脏病药物 地高辛 的生物转化 含量高 疗效较好 副作用比较大 含量低 疗效好 副作用小 希腊毛地黄细胞系 胡之璧 上海中医药大学教授 中国工程院院士 胡氏细胞系 1985年 日本Mitsui 三井 石化工业公司用紫草细胞培养商业化生产紫草素 色素 抗菌抗病毒 用于化妆品 1979年 日本用植物细胞发酵方法大规模培养人参细胞 商业化生产人参皂甙 二 植物细胞大规模培养生产次生代谢物质研究的主要过程 1 选择外植体 诱导愈伤组织 2 通过含量分析 选择高产细胞系 3 研究培养条件 达到高产 稳产 4 建立悬浮细胞培养 优化培养条件 达到高产 稳产 参考3 5 小试 优化培养条件 参考4 6 中试 优化培养条件 参考5 7 大规模培养 参考6 8 工业化生产 产品分离 纯化 适宜的外植体 细胞系 高产细胞系 诱导 建立 选择 高产 稳产细胞系 优化条件 大发酵罐 高产稳产 优化条件 悬浮培养 高产稳产 优化条件 小发酵罐 中试 参考 参考 优化条件 参考 高产稳产 产品提取分离 植物细胞工程流程图 建立 放大培养 高产稳产 工业化生产 优化条件 放大培养 参考 三 提高次生代谢物产量的方法 植物细胞培养生产次生代谢物的研究进行了60年 只有少数成功的例子 如紫草素 人参皂甙 原因 目标化合物的产量低 不稳定 成本高 因此 寻找提高次生代谢物产量的方法对于用植物细胞大规模培养工业化生产次生代谢物极为重要 1 选择 培育高产细胞系 细胞系合成次生代谢物能力对用植物细胞大规模培养工业化生产次生代谢物有决定性的影响 1 不同植物 不同单株 不同外植体 一种次生代谢物可能在多种植物中都有 但含量不同 在同一种植物中 不同植株之间会不同 同一株植物上 不同部位由于生理差异 往往也有不同的次生代谢物合成能力 云南红豆杉 东北红豆杉 中国红豆杉 南方红豆杉 杂种红豆杉 2 对细胞系进行系统选择 在培养过程中 细胞系会出现变异 大量的试验证明 通过持续选择 可显著提高细胞系的生产能力 云南红豆杉细胞系 黄白色细胞 深褐色细胞 云南红豆杉细胞系统选择的结果 植株与细胞系中次生代谢物质含量比较 培养的紫草细胞 SinenxanA R AcSinenxanB R CH3CH2COSinenxanC R CH3CH2CH CH3 CO 紫杉烷BaccatinIII的结构 紫杉醇的母核 紫杉烷Sinenxan的结构 紫杉醇Taxol 3 细胞诱变选择细胞系 如Deus用X射线处理长春花细胞 获得了蛇根碱含量达2 的细胞系 Berlin等用化学诱变烟草细胞 获得了生产肉桂酰腐胺能力提高了10倍的细胞系 4 细胞系遗传改良 利用基因工程技术超量表达限速酶基因 阻断或者改变基因表达 提高细胞系合成次生代谢产物能力 甲羟戊酸途径与植物甾醇 皂素和三萜类物质的生物合成 2 优化培养基次生代谢物的产量 细胞生长量 细胞合成代谢物的能力 培养基 营养物质 激素培养基中营养物质和激素的改变 不仅影响细胞的生长 也会影响细胞的代谢 必然会影响次生代谢物质的产量 培养基及激素对长春花细胞生长和蛇根碱合成的影响 蔗糖浓度的影响 维生素浓度的影响 NO3 NH4 的影响 3 饲喂前体物质 precursor 每种次生代谢产物都有一条生物合成途径 A B C D E F G 前体物质 次生代谢物质生物合成途径中的中间物质实验证明 在培养基中添加前体物质是提高次生代谢物产量的一个有效方法 向鬼臼细胞培养基中添加前提物质使鬼臼毒素含量提高12倍 在添加前体物质之前 必须了解该次生代谢物的生物合成途径 紫杉醇结构可以分为母核 baccatinIII 和侧链两部分 侧链则是由苯丙氨酸与苯甲酸形成的 BaccatinIII是二萜类化合物 而二萜类化合物的生物合成途径已经明确 乙酰辅酶A 紫杉二烯 单萜化合物C10 倍半萜化合物C15 其它二萜化合物 异戊二烯 牻牛儿醇焦磷酸C10 牻牛儿醇焦磷酸C15 牻牛儿醇基牻牛儿醇焦磷酸C20 紫杉二烯环化酶 试验证明 向培养基中添加紫杉醇合成的前体物质 牦牛儿醇 牦牛儿醇基牦牛儿醇 苯甲酸 苯丙氨酸等 可以使红豆杉细胞中紫杉醇含量提高数倍 4 使用诱导子 elicitor 诱导子 指能刺激细胞合成次生代谢产物的物质 诱导子分为生物诱导子和非生物诱导子 生物诱导子是指微生物 特别是致病微生物 活菌 高温灭菌后的菌物或其匀浆物 纤维素酶 果胶酶 微生物多糖等 非生物诱导子是指重金属离子 Ag V2 Hg2 Cu2 或Ca2 等 诱导子一般是在细胞培养的中后期 接近细胞最大生长期 加入 诱导子促进植物次生代谢物质合成的作用 5 改善培养环境 温度 光照 pH 温度 光照和pH值对细胞生长和合成次生代谢物质的影响因植物种类而异 最佳条件需要通过试验才能确定 光照 光照可以刺激长春花细胞合成蛇根碱 银杏细胞合成黄酮 却抑制黄连细胞中小檗碱 红豆杉细胞中紫杉醇的合成 温度 对细胞生长和次生代谢物合成的影响往往不一致 如长春花和骆驼蓬细胞的最佳生长温度分别是27 和30 但合成生物碱的最佳温度是分别是16 和25 但胡萝卜在25 和28 时细胞合成花色素的能力无差异 培养基的酸碱环境 如雷公藤细胞合成雷公藤素乙的能力在pH6 0时最强 番薯细胞合成色醇的能力在pH6 3时最大 在pH4 8时则不能合成 胡萝卜细胞合成花色素的能力在pH4 5时最强 提高pH值则导致合成能力下降 6 改进培养方法 1 两步培养法 细胞生长与次生代谢物合成所需要的条件往往不同 并且不同步 对于生长和次生代谢物质合成不同步的植物细胞 如次生代谢物质在细胞生长后期积累 可以在前期采用促进细胞生长的培养基和培养条件 在后期采用促进次生代谢物合成的培养基和培养条件 从而兼顾细胞的生长量和次生代谢物的合成 达到提次生代谢物产量的目的 云南红豆杉细胞生长与紫杉醇含量动态 紫杉醇含量 生长量 2 两相培养法 根据化学反应平衡原理知道 产物的积累会抑制化学反应正方向的速度 反馈调节 移去产物则可以促进化学反应朝正方向进行 同时 产物的积累还可能会对细胞生长有毒害 因此 如果能将次生代谢物收集起来 就可以促进代谢物的合成 两相培养可以解决这个问题 两相培养法有2种方式 液 固培养 液相是细胞和液体培养基 固相是能吸收次生代谢物的物质 如树脂 活性炭等 液 液培养 一层液相是细胞和液体培养基 另一层液相是能溶解次生代谢物的有机溶剂 如乙酸乙酯 正己烷等 对细胞无毒 这2种方法都可以减少培养基中次生代谢物浓度 防止负反馈调节 从而提高代谢物的产量 特别是在培养基中加入促进细胞内次生代谢物向培养基中分泌的物质 如DMSO 时 效果更好 香竺葵细胞两相培养 液 液培养 倍半萜的产量提高了500倍 第四节毛状根培养与次生代谢物生产 毛状根 hariyroot 发根 是在发根农杆菌诱导下植物形成的细小 多分枝的不定根 青蒿的毛状根 烟草的毛状根 毛状根的优点 1 生长快 2 不依赖激素 3 具有组织结构 对于生产一些需要细胞出现组织化才能大量合成的次生代谢产物特别有意义 毛状根是生产次生代谢产物的一个很有潜力的方法 悬浮细胞 再生根 毛状根 长春花 总生物碱含量 培养时间 days 1986年 ManoY 等建立的29个日本莨菪毛状根无性系均能生产阿托品烷生物碱 从中选育出的克隆 其生长速度比正常植株高102倍 莨菪碱含量达1 3 为原植株根中含量的3倍 1987年 Yochikawa等人通过诱导人参毛状根 其生长速度为用外源激素诱导根的2倍 人参皂甙含量达干重的0 95 为天然根的2倍 0 4 以上 1990年 Furuga等用20吨的发酵罐进行人参毛状根的培养 每月产量为4吨的新鲜培养物 1993年 孙敏等诱导出盐芙木的毛状根 从296个无性系中筛选到4个生长快 分支多的萝芙木转化根系 其中一个的利血平含量是干重的0 124 为原植株的3倍 1996年 芮和恺等诱导的黄芪毛状根16d内可增殖404倍 1997年 郑志仁等用发酵罐大量培养黄芪毛状根 3星期后 毛状根生长量分别达到35倍 1997年 黄遵锡从短叶红豆杉诱导出毛状根 选育出的5株无性系20d后生物量增加9倍 紫杉醇含量是愈伤组织的1 3 8 0倍 毛状根的诱导 发根农杆菌 革兰氏阴性土壤杆菌 自然界中普遍存在 其特点是能感染双子叶植物 并引起植物形成肿瘤或者毛状根 毛状根诱导机理 发根农杆菌中Ri质粒上一段DNA T DNA transferDNA 含有rolA roB rolC rolDgenes 转到了植物细胞基因组中 引起植物细胞毛状根 毛状根诱导过程 1 外植体选择和表面消毒 2 发根农杆菌的活化与培养保存的农杆菌在YEP培养基上化平板 单菌落接种在液体YEP培养基中 28 200rpm 2days 1 30 50放大培养 28 200rpm 6 7h OD600 0 5 0 8 离心收集菌液 悬浮在MS0培养基中 3 感染 5 30min 4 共培养 在无激素 有乙酰丁香酮的培养基上培养2 5天 5 毛状根形成 在无激素 有抗生素培养基 毛状根的形成 毛状根诱导是发根农杆菌介导的植物转基因 诱导效率受到很多因素的影响 形态不一
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