等度高效液相色谱测定大豆异黄酮中大豆甙元和金雀异黄酮.docx

等度高效液相色谱测定大豆异黄酮中大豆甙元和金雀异黄酮林疆杨兰钦唐根源(福州福龙生物制品有限公司 ,福建福州350015 )摘 要 :本文介绍了等度高效液相色谱 ( h plc)测定大豆异黄酮中二种主要成份 : 大豆甙元 (d a idze in)和金雀异黄酮 ( gen iste in)的方法 。采用 a tlan tis c18色谱柱和 ea sygua rd c18 ,保护柱 ;以甲醇 : 011%醋酸 ( ph3111 ) = 5115: 4815 ( v / v)为流动相 ;检测波长 = 254nm; 流速 1ml / m in。在测定范围内 ( 10 - 200 ng)峰面积与质量浓度线性关系良 好 。大豆甙元和金雀异黄酮的相关系数分别为 019984, 0199971两组份回收率为 9710102192 % 1关键词 :高效液相色谱 ;大豆异黄酮 ;大豆甙元 ;金雀异黄酮中图分类号 : o657172 文献标识码 : a 文章编号 : 1009 - 8143 ( 2006 ) 02 - 0015 - 02d e term ina t ion of the d a idze in an d the gen iste in in the soy bean isof lan ove s byisocra t ic e lu t ion h igh perform an ce l iqu id c hrom a togra phyl in j ian g y an g l an q in tan g gen yuan( fuzhou fu long b io logica l p roduc ts co1, l td1fuzhou1fu jian, 350015 , ch ina)a b stra c t:a n ana lytica l app roach ha s been deve lop ed fo r isoc ra tic e lu tion h igh p e rfo rm ance liqu id ch rom a tograp h ic de te rm i2 na tion of d a idze in and gen iste in in the soy bean isoflanove s1they we re m ea su red u sing a tlan tis c18 fo r ana lytica l co lum n and ea sygua rd co lum n c18 fo r gua rd co lum n, and uv de tec to r ( a t 254nm ) 1the mob ile p ha se wa s m e thano l : 011% ace tic ac id ( ph3111) = 5115: 4815 ( v / v) 1 the re wa s a good linea r re la tion sh ip be tween the con ten t of d a idze in, gen iste in and its p eak a rea, w ith the co rre la tion coeffic ien ts of 019984 and 019997 re sp ec tive ly, a ve rage recove rie s we re 9710 % - 10310 % 1key word s: h igh p e rfo rm ance liqu id ch rom a tograp hy; soy bean isoflanove s; d a idze in; gen iste in大豆异黄酮对心脑血管具有保护作用 ,可降低胆固醇 ,防止骨质疏松 1 - 3 ,同时大豆异黄酮具有极 强的 抗 氧 化 能 力 4 , 有 保 护 皮 肤 , 美 容 养 颜 之 功 效 5 ,市场上有的化妆品 中 就添 加了 大 豆异 黄酮 。 我们利用高效液相色谱对两种进口 的大 豆 异黄 酮(法国 crodarom 公司 ,日本 ichumulu 公司 )中 的二种主要成份大豆甙元和金雀异黄酮进行定量测 定 ,为监控进口大豆异黄酮的质量提供了有力保障 。大豆异黄酮的测定以高效液相色谱为主 6 - 8 ,分光光度法只能测定异黄酮总量 9 ,大豆异黄酮组 份结构极其相似 。,再加上杂质的干扰 ,增加了测定难度 。因而在高效液相色谱方法中 ,一般需要梯度洗脱方式 。我们建立了 等度 反 相高 效液 相 色谱 方 法 ,能达到定量分析要求 ,又简化了分析方法 ,缩短 了分析时间 。1 实验部分111 主要仪器和试剂w a te rs 650 e高效液相色谱仪 ( 486 可调波长检 测器 , 746 数 据处 理 机 , u 6 k 进样 阀 ) , 510 泵 (w a2te rs) , m illi - q50 水 纯 化 系 统 (m illipo re ) , 酸 度 计(上海雷磁 ) 1大豆甙元 (含量 3 99 % ( h plc ) ) ( sigm a ) ,金雀 异黄酮 (含量 3 99 % ( h plc ) ) ( sigm a ) , 水 (m illi -q50 ) , 大 豆 异 黄 酮 (固 体 ) (法 国 crodarom 公司 ) ,大豆异黄酮 (液体 ) (日本 ichumulu 公司 ) 1甲醇 (a 1r ) ,醋酸 (a1r ) 1112 标准样品溶液配制分别 准 确 称 取 大 豆 甙 元 和 金 雀 异 黄 酮 各1215m g,用少量流动相溶解后移入同一 25ml 容量 瓶中 ,用流动相定容 ,摇匀 ,静止片刻后取 1ml 混合收稿日期 : 2005 - 7 - 28作者简介 :林疆 ( 1970) ,男 ,工程师 ,从事化妆品 、保健品的研制和开发工作 。联系电话 : 0591 - 8368168616福建分析测试研究简报2006, 15 ( 2)标样溶液置于 100ml 容量瓶中 ,用流动相定容 。混合标样浓度 :大豆甙元和金雀异黄酮都为 5g /ml。 作为 h plc标准溶液 ,用前经 0145m 滤膜过滤 。113 色谱分离条件色谱 柱 : a tlan tis c18 , 5m , 416 150mm (w a2 te rs) ,保护柱 : ea sygua rd c18 , 5, 8 4mm (d ikm a ) ; 流动相 : 甲 醇 : 011 % 醋 酸 ( ph 3111 ) = 5115: 4815( v / v) ; 检测波长 : = 254 nm ( 6 ) ; 流速 : 110ml /分 ;室温 1114 样品制备溶解后置 100ml 容量瓶中 , 用流动相定容 , 则浓度为 01266m g /ml。用前经 0145m 滤膜过滤 。11412 日本 ichumulu 公司 样 品 (液 体 ) , 简称 j- ifnv。在 25ml 容 量 瓶 中 精 桷 称 取 j - ifnv 样 品117378克 ,用流动相定容 ,则浓度为 691512m g /ml ,用前经 0145m 滤过 。2 结果和讨论211 样品分析11411 法国 crodarom 公司样品 (固体 ) ,简称f21111性 , f -用绝对保留时间法和样品加标样重叠法定ifnv 和 j - ifnv 样品谱图如图 1、2。-ifnv。精确称取 f - ifnv 样品 2616m g用流动相溶液图 1 f - ifnv 色谱图a110141 大豆甙元b116190 金雀异黄酮图 2 j - ifnv 色谱图a110145 大豆甙元b116197 金雀异黄酮进样 ,结果如下表 (表 1 )21112 定量分析用峰面积外标法定量 ,标样和样品采用等体积表 1 样品测定结果测定内容大豆甙元金雀异黄酮平均 ( n = 5 )3173%标准偏差 ( s)0106062变异系数 ( r sd % )1162平均 ( n = 5 )1150 %标准偏差 ( s) 变异系数 ( r sd % )样品名称f ifnv01052443150 j ifnv 2125m g / 100 g 0104301 1191 0168m g / 100 g 0102598 3182 212 回收率取 f - ifnv , j - ifnv 样品各一份 , 1 份进行含 量测定 (作为本底 ) ,另一份加入精确称重的大豆甙元 、金雀异黄酮标样 ,经同样方法处理后进行加标回收率的测定 (表 2 )表 2 方法回收率样品大豆甙元金雀异黄酮名称f ifnv本 底 (g) 加入量 (g) 测定值 (g) 回收率 ( % )本底 (g) 加入量 (g) 测定值 (g) 回收率 ( % )10117125101271021011124116525106615899172 j ifnv 17131 2510 43104 102192 8165 2510 32190 97100 (下转第 20页 )20福建分析测试研究简报2006, 15 ( 2)是 0110 , 0110不仅是地质成图的等值线的差值 ,又是样品测定值大于 3倍检出限的对数偏差允许值 。3 结语外部标准控制样代表了全部检测样的分析质量 状况 。因此说以上论述的方法 ,不仅控制了外部的 标准控制样分析质量 ,而且控制了按暂行规定 要 求内部密码插入 8 %国家一级标准物质监控样 、5 % 的内检样 ,直至全部检测样品的分析质量 。以上论述的方法不仅可应用于多目标地球化学 样品测试中 ,而且可适用于不同实验室间的样品比 对 ,或能力验证中 。尤其当前准备与国际间互相认可的实验室 ,以上论述的各质量监控法 ,可做借鉴 。参 考 文 献 1 叶家瑜 1地质实验工作 50周年文集 m 1北京 : 地质出 版社 , 2003: 2801 2 中华人民共和国地质矿产部 ,地质矿产实验室测试质量 管理规范 m 1 西安 : 西安交通大学出版 社 , 1994: 55 -601 4 郑用熙 1分析化学中的数理统计方法 m 1 北京 : 科学 出版社 , 1991: 1201受污染的可能性小 ,自动化程度高的特点 ,在多目标样品 54 个分析项目中 ,它可承担大约 25 个分析项 目的检测 。数万个样品的测试证明 , f 值的主要影响因素 是 :基体 、标准物质的数量 、标准物质的含量 。样品 的基体 、待测元素的含量愈接近参与回归曲线的标 准物质 ,分析的精确度就愈高 。如果参与回归曲线 的标准物质的数量不够多 ,测定的准确度就会降低 ;如果参与的标准物质数量足够多 ,但其含量无法涵 盖样品的含量 ,分析的准确度将受到影响 ,势必也影 响到 f检验值 。215 测试质量警告限的系数不是偏差 01051 / 2 , 而是对数多目标生态地球化学样品成图的等值线的差值为对数的 0110 ,根据此类样品分析的特性 , 地矿部 门实施多年的规范第 2 页述及的有关要求 ,即测试质 量 警 告 限 为 分 析 误 差 允 许 值 的 1 / 2 (即017071 ) ,适 应 性 不 强 , 而 应 采 用 对 数 偏 差 允 许 值0110的一半 , 即对数偏差 0105 作 为 警告 限 。其 理论依据 :一是系统误差的 + 0105与- 0105 的绝对值(上接第 16页 )213 线性回归和相关系数取大豆甙元 、金雀异黄酮的混 合 溶液 (浓度 都 为 5g /ml ) , 取 215l、5l、10l、15l、20l、25l 分析 ,结果以峰面积 y为纵坐标 ,待测物大豆 甙元 、金雀异黄酮质量浓度 x (g /ml )为横坐标 ,进行回归计算 ;大豆甙元和金雀异黄酮的回归方程和 相关系数分别为 y = 3126 + 1136x, = 019984 和 y= 7108x - 0106 , = 0199971214 我们用 20l /ml 的溶液进样 20l ,大豆甙元 的峰形既宽又不对称 ,但样品中的大豆甙元的峰形正常 ,我们一度怀疑标样纯度不够 。我们改用 5g / ml 的标准溶液分析 ,大豆甙元的峰形正常 ,说明我 们使用的色谱柱 a tlan tis柱容量不大 ,原来的峰形不 好是柱子过载所致 。215 大豆异黄 酮成 份 复杂 , 一 般采 用浓 度 梯度 洗脱 ,我们根据自已工作条件和具体分析对象 ,建立了 等度洗脱方法 ,完全能满足定量要求 。216 从谱图分析 ,大豆异黄酮中的几个主要成份分 离良好 ,因受标样限制 ,我们只对二个主要成份 (大 豆甙元 、金雀异黄酮 )定量 ,我们的体会是在定量分析中尽量避免梯度洗脱 ,以免带来不必要的麻烦 。217 f - ifnv 和 j - ifnv ,一个是固体样品 ,另一个是液体样品 ,二个样品的优劣很难比较 ,单从大豆 甙元和金雀异黄酮二个主要组份 ,尤其是金雀异黄 酮 , f - ifnv 优于 j - ifnv ,