硝化细菌的简介及研究思路.doc

1.1 问题的提出1.1.1 我国水体富营养化状况我国是一个湖泊众多的国家，大于1 km2的天然湖泊就有2300多个，湖泊面积为70988 km2，约占全国陆地总面积的0.8。湖泊总蓄水量为7077多亿m31。调查结果表明：2004年七大水系的412个水质监测断面中，IIII类、类和劣类水质的断面比例分别为41.8、30.3和27.9，七大水系主要污染指标为氨氮、五日生化需氧量、高锰酸盐指数和石油类3。2004年监测的27个重点湖库中，II类水质的湖库2个，III类水质的湖库5个，类水质的湖库4个，类水质湖库6个，劣类水质湖库10个。其中，“三湖”（分别为太湖、巢湖和滇池）水质因总氮和总磷浓度高而均为劣类。太湖水质与上年比有所改善，但仍处于中度富营养化状态。滇池的草海属于中度富营养化，外海属重度富营养化。巢湖水质属中度富营养化。对于海洋环境，2004年全海域共发现赤潮96次，较上年减少23次。赤潮累计发生面积266630平方公里，较上年增加83.0，其中，大面积赤潮集中在东海。目前，水体的富营养化已经成为我国最为突出的环境问题之一。许多大型湖泊，如巢湖、太湖、鄱阳湖、滇池和西湖等，都已经处于富营养或重度富营养化状态。而且一些河流在部分河段也出现了富营养化现象，如黄浦江流域、珠江广州河段等。据统计，我国主要湖泊处于因氮、磷污染而导致富营养化的占统计湖泊的564。因此，如何治理富营养化的水体，减少其中的营养物质的含量，回复水体的综合功能，已成为当前全球性的环境问题的研究热点5。1.1.2 富营养化水体的微生物治理针对水体富营养化现象，其水质改善及对策包括三个大的方面：污染源控制对策、水体生态修复对策以及应急除藻对策6-8。水体富营养化的关键与核心是生物多样性的破坏，其典型表现就是富营养化水体发生藻类“水华”现象9。因此，从保护和恢复生物多样性入手，引入微生物、植物和动物，尤其是关键物种，重建食物链结构，是恢复水体正常的主要手段之一10-12。为此经常用到的技术措施包括：以藻控藻，投加细菌微生物13、放养鱼类14，恢复与构建水生植被15,16等。利用微生物种群的新陈代谢活动对富营养化水体中的有机污染物、氨氮和有机氮等进行去除，尤其是氮污染物的去除，主要需要建立硝化反硝化体系。而在自然界中，原本存在有专门从事硝化反硝化过程中的微生物种群。但是由于某些微生物种群，如硝化细菌的代时较长，增殖速率非常低。同时，水体的人为活动的破坏。导致了富营养化水体中硝化反硝化体系的弱化甚至缺失。故针对富营养化水体，可采用向水体中投加复合微生物菌群，从而增强水体的生物自净化能力，达到控制水体富营养化的目的，该技术被称之为“微生物强化技术”。该技术具有费用低、见效快、无污染和方便安全等特点。复合微生物种群主要由光合细菌、硝化细菌等组成，再辅之以反硝化细菌。其中，光合细菌通过自身代谢与藻类竞争性争夺营养物质，并可降解、消除藻类代谢分泌于体外的多种物质，削弱藻类的竞争力。一般的光合细菌都有固氮能力，在厌氧光照条件下固氮能力最强。光合细菌与其他细菌的混合培养，能够提高其他细菌的固氮能力。另外，硝化细菌、反硝化细菌可针对水体中的有机氮和氨氮等进行降解处理。硝化细菌的生长条件是偏碱性的好氧环境。光合细菌在代谢过程中可产生碱性物质，从而为硝化细菌提供了碱性环境。潘涌璋17等应用复合微生物培养液和BBL1菌剂，采用投加菌液的方法对富营养化人工景观湖水进行了净化试验，氨氮的去除率大于90。杨世平18等人利用固定化硝化细菌处理养殖废水，24小时后COD去除率为74.9，氨氮去除率82.5。周康群19等利用投加氨氧化菌、亚硝酸盐氧化菌、芽孢菌和假单胞菌等于广州市西村水厂的水源中，可降解氨氮4094.5。黄晓东20等人利用角野以聚丙烯酰胺凝胶为固定化载体，用包埋法固定硝化细菌，并以7.5的填充率将固定化细胞透入到内循环的流化床中，对按标准活性污泥法运行、含硝化细菌极少的曝气池活性污泥混合液进行连续处理实验，停留时间仅为2小时，就可达到完全硝化。据Wagner M21等报道：某化工厂在采用两步生物增强技术，投加降解硝基苯和对硝基苯的菌以及氨氧化菌后，可将出水中的NH4+-N从120 mg/L降到20 mg/L。1.2 硝化细菌的分类及研究现状生物硝化作用（NH3NO2-NO3-）在地球氮素循环过程中扮演着极其重要的角色。生物硝化作用主要通过硝化细菌中两个“关键”共生菌群对氮素的迁移和转化作用来实现，这两个共生菌群分别是将氨氮氧化成亚硝酸盐的氨氧化菌（ammonia-oxidizing bacteria ，AOB）和将亚硝酸盐氧化成硝酸盐的亚硝酸盐氧化菌（nitrite-oxidizing bacteria，NOB）22。1.2.1 硝化细菌的分类根据伯杰氏鉴定手册第8版分类，硝化细菌统归于7个属，分别是硝化杆菌属（Nitrobacter）、硝化刺菌属（Nitrospina）、硝化球菌属（Nitrococcus）、亚硝化单胞菌属（Nitrosomonas）、亚硝化螺菌属（Nitrosospira）、亚硝化球菌属（Nitrosococcus）和亚硝化叶菌属（Nitrosolobus），共14种。伯杰氏细菌鉴定手册第9版中除了收录上述7个属外，另增加有2个属，分别是硝化螺菌属（Nitrospira）和亚硝化弧菌属（Nitrosovibrio），总共20种。这些菌种的分布很广，分布于土壤、湖泊及底泥和海洋等环境中23。基于16S rRNA基因序列同源性的系统发育分析表明，所有的自养型氨氧化菌系统发育较为单一，他们皆属于变形菌纲（Proteobacteria）亚纲和亚纲（图1所示）24，其中属于亚纲的氨氧化菌又可以分为两个类群：亚硝化单胞菌群（Nitrosomonas）和亚硝化螺菌群（Nirosospira）。其中，亚硝化单胞菌群包括欧洲亚硝化单胞菌属（Nitrosomonas europaea）和运动亚硝化球菌（Nitroscoccus mobilis）；亚硝化螺菌属包括所有的属于亚硝化螺菌属（Nitrosospira）、亚硝化弧菌属（Nitrosovibrio）和亚硝化叶菌属（Nitrosolobus）的菌株，从进化距离上看，这3个属可完全归于1个属。图1-1 依据16SrRNA基因序列构建的硝化作用微生物的系统发育25Fig. 1-1 Systematic evolution of nitrifying bacteria based on the sequences of their 16S rRNAThe sequences of 16SrDNA were from GenBank, and accession numbers from up to down were L35503, L35504, Y14636, Y14644, L35511, L35507, M96400, M96399, M96396, M96397, M96401, M96404, L35510, and M96395与氨氧化菌不同，亚硝酸盐氧化菌的系统发育则要复杂许多，Bock E等26人的研究结果表明，亚硝酸盐氧化菌的4个属分属于不同的4个系统发育类型（图1）。如，硝化杆菌属（Nitrobacter）属于变形菌纲的亚纲，硝化球菌属（Nitrococcus）属于亚纲，硝化刺菌属（Nitrospina）属于亚纲、硝化螺菌属（Nitrospira）属于硝化螺菌门（phylum Nitrosira）。以上这些内容充分说明了生物硝化作用中的微生物在进化上系统发育起源的异源性。Lipski A等27人研究了亚硝酸盐氧化菌的脂肪酸图谱，结果表明，亚硝酸盐氧化菌中各属所含的脂肪酸存在较大差异，并有各自的特征脂肪酸，所得结果与16S rRNA基因序列相似性分析的结果相吻合26。1.2.2 硝化细菌的特征1硝化细菌的自养性硝化细菌绝大部分种类皆为专性化能的自养菌，它们能够利用氨氮或者亚硝酸盐获得合成反应所需的化学能。在有机培养基上几乎不生长（维氏硝化杆菌除外），也不需要外源的生长因素。它们对底物的专一性很强，氨氧化菌以氨氮为底物提供能量，亚硝酸盐氧化菌以亚硝酸盐为底物提供能量。2生长缓慢，二均分裂28硝化细菌是化能自养型菌，其由自身合成糖类，这一过程需要较长的时间。因此，硝化细菌的平均代时一般都在10h以上。大多数种类为无性的二均分裂，只有维氏硝化杆菌为出芽繁殖。3好氧性硝化细菌皆为好氧生长，O2是最终的电子受体。硝化细菌正常代谢需要溶解氧，溶解氧供给不足可破坏氨氧化菌和亚硝酸盐氧化菌之间的生态平衡。4形态多样性硝化细菌均为革兰氏阴性菌，无芽孢，无荚膜。虽然生理学上具有共同性，但是，同一生理亚群中的种类，其细胞形态却多种多样，例如，球形、杆形、螺旋形等。其细胞膜大多具有复杂的薄膜状、囊泡状和管状膜内褶结构。DNA中GC分子百分含量范围较窄，氨氧化菌的含量略高于亚硝酸盐氧化菌。5分布硝化细菌对溶解氧、温度、pH等外界环境因素的变化反应较为灵敏，易受外界环境的影响。有些属分布较广，有些则较局限，如硝化球菌和硝化刺菌属的种仅分布在海水中。1.2.3 硝化细菌的检测方法早期对于硝化细菌的检测是通过菌体分离、培养，然后形态观察来进行的。但是，由于硝化细菌为化能无机自养型微生物，其生长速率十分缓慢，分离和培养硝化细菌的周期特别长，以硝化杆菌为例，在实验室试验中，其最短的代时也在7h以上。而在自然环境中，绝大部分的硝化细菌由于底物、溶解氧、温度和pH的限制，其代时更会长达几天或者数周。同时，硝化细菌个体小，形态观察十分困难。硝化细菌这种缓慢的生长速率严重的阻碍了对硝化细菌数量的检测，同样也使得对硝化细菌的菌群构成和硝化动力学等方面的研究陷入困境29-31。在一个复杂的环境系统中，常规的硝化细菌检测方法为MPN法32-35。此方法是建立在统计学基础之上。然而，实施MPN法不仅耗时，而且容易对硝化细菌的数量造成低估，更不能对不同种的硝化细菌进行有效区分36,37。根据培养基和培养条件的不同，MPN法仅仅只能对硝化细菌菌群中的一小部分进行计数。可以看出，MPN法已经不能适应硝化细菌的研究。近20年来，随着分子生物学技术的迅速发展，尤其是PCR技术、DNA测序技术以及核酸杂交和多态性技术的广泛应用，使人们从分子水平研究硝化细菌成为可能。通过抗体或16S rRNA的寡聚核苷酸探针，复杂环境中的硝化细菌可以被检测出来。荧光抗体技术可以被直接应用于复杂环境系统中硝化细菌的检测38-41。Voytek等（1995）利用嵌套引物两步PCR扩增16S rRNA基因及荧光探针杂交法检测了分离菌种和环境样品中Proteobacteria亚纲的氨氧化菌42；Deni等（1995）利用16S rDNA引物特异性扩增了397bpDNA片段，对土壤中的硝化杆菌（Nitrobacter）进行检测和计数43。明镇寰等利用PCR对炼化厂生物硝化池曝气池中的硝化细菌进行检测，大大缩短了检测时间（整个过程大约需要6小时），而且劳动量小，灵敏度高44。但是，对于识别细胞壁上特异抗原的抗体，其首先需要分离纯化得到靶细胞。尽管如此，这种抗体也仅仅只能识别极少部分的硝化细菌类别。而最近，以关键酶，如氨氧化还原酶和亚硝酸盐氧化还原酶为目标的抗体已被开发成功45, 46。该技术的优点是，其克服了抗体只能识别细胞壁上位点的问题。这种抗体技术已经成功的应用于环境样品中硝化细菌的检测和关键酶的生理生化研究上47, 48。另外，环境样品中的硝化细菌可以通过不同的PCR技术得以检测，通常使用16S rRNA49-50和关键酶51,52序列作为对象。其中，利用此原理的最为参见的方法就是荧光原位杂交（Fluorescence in situ hybridization，FISH）技术53 - 55。除了上述方法外，Lipski56等人研究发现，硝化细菌体内的脂肪酸具有系统发育的多样性，因此，可以作为硝化细菌不同种群的检测手段。1.2.4 硝化细菌的生长代谢硝化细菌作为一种化能自养型微生物，其可以利用无机氮源促进生长。同时，又可通过卡尔文循环固定CO2，为生长提供碳源。但是，硝化细菌区别于纯粹的化能自养型微生物，在生长过程中添加有机物质可刺激细胞的生长和增值57, 58。此外，硝化杆菌也可以利用丙酮酸、蚁酸盐和醋酸盐等作为碳源进行异养型代谢提供能量59。然而，整体上说，硝化细菌的这种异养型生长终归是慢于自养型生长60, 61。另外，亚硝化单胞菌属和硝化杆菌属在低溶氧和缺氧环境下都可进行反硝化反应，从而产生氧化一氮、氧化二氮或四氧化二氮等562- 64。而且研究表明，亚硝化单胞菌属还可利用二氧化氮或四氧化二氮作为氧的电子供体，而不需要O265, 66。以下为氨氧化菌和亚硝酸盐氧化菌两类主要硝化细菌种群的基本生化代谢情况。1.2.4.1 氨氧化菌的生长代谢氨氧化菌通过氧化氨氮为生长提供能量，此过程需要两个关键酶进行催化作用，分别是氨单加氧酶（ammonia monooxygenase，AMO）和羟氨氧化还原酶（hydroxylamine oxidoreductase，HAO）。过程分为两步进行。第一步，AMO氧化NH3为羟胺。此过程又分为两个部分：O2经放能还原反应生成水；而后，其生成的能量促使NH3和氧气作用生成中间产物羟胺67。第二步由羟氨氧化还原酶参与，氧化羟胺生成亚硝酸盐。此过程亦分为几个部分组成，具体如下：整个氧化过程，可以通过图2反应出来。图 1-2 欧式亚硝化单胞菌属的电子传递链模型AMO=氨单加氧酶；C=细胞质；Cyt=细胞色素；HAO=羟胺氧化酶；NIR=亚硝酸盐还原酶；P=细胞周质；UQ=辅酶QFig. 1-2 Model of electron transport chain of NitrosomonasAMO = ammonia monooxygenase; C = cytoplasimc side og the membrane; Cyt = cytochrome; HAO = hydroxylamine oxidoreductase; NIR = nitrite reductase; P = periplasimic side of the membrane; UQ = ubiquinone1.1.3.2 亚硝酸盐氧化菌生长的生化机制由亚硝酸氧化为硝酸盐只需一步完成，该反应由亚硝酸氧化酶系统来参与进行，电子经细胞色素传递给O2，再通过氧化磷酸化产生ATP，过程如图3所示。图1-3 硝化杆菌属的电子传递链模型C=细胞质；Cyt=细胞色素；NOR=亚硝酸盐氧化还原酶；P=细胞周质；TCC=三羧酸循环；UQ=辅酶QFig. 1-3 Model of electron-transport chain of NitrobacterC = cytoplasmic side of the membrane; Cyt = cytochrome; NOR = nitrite oxidoreductase; P = periplasmic side of the membrane; TCC = tricarboxylic acid cycle; UQ = ubiquinone pool.在亚硝酸盐氧化菌中用亚硝酸氧化酶将亚硝酸盐氧化成硝酸盐；电子通过一个极短的电子传递链（因为N03-/N02-具有高电势）传给终端氧化酶。细胞色素a和c参与亚硝酸氧化剂的电子传递，并通过细胞色素aa3的反应产生一个质子动力，最终促进ATP的形成。因为只有很少的一部分能量能被硝酸细菌利用，所以硝酸细菌的生长率更低。1.1.3.3 硝化细菌的生长速度硝化细菌与异养细菌的生长方式和消耗底物的类型是完全不同的。细菌的反应动力常数与其底物的有效性有关。在处于最大活性时，它们都能消耗自身总量几倍的底物。但硝化细菌只将少量的底物转化为细胞成分，大部分ATP用于合成NADPH，而异养细菌则将大量的底物转化为新细胞68。因此，硝化细菌的生长速率相对而言缓慢得多。如Nitrosomonas在1020，pH 6.57.5的生长率为0.10d-10.61d-1，Nitrobacte为0.10 d-10.45d-1 69，比那些异养细菌的生长速率要慢许多。另一个重要的特性是，硝化细菌在较低底物浓度的环境中即可维持最大的反应活性，所需的底物浓度是异养细菌的1%70。表1-2 氨氧化菌、亚硝酸盐氧化菌和异养细菌的动力学常数Table 1-2 The kenetic parameters of AOB, NOB and heterotrophic bacteria细菌类群底物消耗速率（mg/mgd）比生长速率（/d）增长效率（mg /mg底物）饱和常数（mg/L）氨氧化菌6200.52.00.050.291亚硝酸盐氧化菌10400.21.00.020.081异养型细菌203010150.40.5751251.2.5 环境因子对硝化细菌的影响 硝化细菌作为自然界氮素循环的重要组成部分，其具有不可或缺的作用。但是，由于硝化细菌本身为化能自养型细菌，且其代时较长等特殊性，决定了硝化细菌对环境因子即为敏感。其中，主要的影响因子如下： 1温度温度对硝化细菌的生长和氧化速率的影响很大。根据伯杰氏细菌鉴定手册中所记录，硝化细菌的最适温度为1035范围了，高于或低于此温度范围，硝化细菌的生长和氧化速率都会受到极大的影响。如温度低于10，硝化细菌的生长速率减慢，同时其亚硝酸盐氧化速率和氧化活性衰减速率也同时降低71。而温度高于35时，高温直接对硝化细菌的酶系产生不可逆的破坏。在1035范围内所以，温度每升高10，硝化速率可提高3倍72。因此，在进行硝化细菌培养时，应尽量将温度控制在2030范围。2pHpH对微生物的主要作用在于，其可引起细胞膜电荷的变化，从而影响了微生物对营养物质的吸收；影响代谢过程中酶的活性；改变生长环境中营养物质的可给性；以及有害物质的毒性。因此，pH也是影响硝化细菌的重要因子之一。一般来说，氨氧化菌的最适pH值为7.07.8，而亚硝酸盐氧化菌的pH在7.78.1。此时，两者的活性最高73。但是有文献报道，氨氧化菌的最适pH范围是7.08.5，亚硝酸盐氧化菌的最适pH范围是6.07.574。Shammas75和Groenewegh76等人认为，硝化反应的适宜pH在7.59.0之间，最佳pH在8.08.5。当pH6.5或者pH9.8时，硝化速率降低50以上。当pH5.5时，硝化反应则完全停止。综合来讲，硝化细菌的最适生长pH为弱碱性环境，不同的环境系统中，硝化细菌的最适生长和硝化pH范围会有所不同。 此外，pH值和温度一同作用，决定了氨在总氨氮中的比例，氨对于硝化细菌是具有微量的毒性作用。当氨的浓度达8mg/L时，就能对硝化细菌产生抑制77。亚硝酸盐氧化菌的硝化活性对环境中的pH变化较为敏感，往往pH发生变动，短时间内，硝化细菌的活性便会发生显著性的变化72。3COD硝化细菌属于化能自养型微生物。因此，早期人们普遍认为，有机物对硝化细菌具有一定的毒害作用。但是，众多的研究和实践证明，有机物（非有毒有机物）对硝化作用并无特定的毒害作用78。产生毒害现象的原因可能是，有机物的存在促进了异养细菌的快速生长，从而导致其与硝化细菌竞争氧和其他营养物质，而使得硝化细菌的生长受到限制，但有机物本身并不直接影响硝化细菌的生长与硝化作用79。Hanaki也认为有机物导致硝化作用的降低不是直接毒害作用的结果，其分析原因可能有两点：一是异养菌的同化作用导致氨的减少；二是异养细菌细胞的凝聚体会对氨的氧化作用产生抑制作用。二者共同作用导致了硝化作用的降低。3渗透压硝化细菌对渗透压的能力较强，这主要由硝化细菌的生长环境所决定。一般来说，从淡水到海水，硝化细菌都有相关的种属生活其中。即使环境条件土壤发生变化，例如，从淡水突然转到海水中，多数的硝化细菌可以快速适应环境，且活性的变化不大80。从某种意义上可以说，渗透压对硝化细菌没有影响，因此，在众多的文献报道中均不将渗透压作为硝化细菌的主要研究内容。4溶解氧硝化细菌皆为好氧菌，因此，在生长过程中需要氧来提供电子供体，从而获得能量。一般来说，每毫克氮素经过硝化作用途径后，由氨转变为硝酸根，最大需要4.57毫克溶解氧来“清除”含氮物质释放的电子81。研究认为，硝化过程中溶解氧的浓度一般控制在1.0 mg/L2.0 mg/L比较好，过高和过低的溶解氧含量都会不利于硝化细菌的硝化能力。溶解氧过低会对硝化细菌的生长和硝化细菌的活性产生抑制，溶解氧过高则会对污泥深处中反硝化细菌产生抑制作用，不能把由硝化细菌产生的硝酸盐最终从污水中去除，从而硝酸盐反过来也抑制了硝化细菌的生长和活性。Eckenfelde提出DO浓度必须在2mg/L以上；也有人提出DO不能低于0.5mg/L；还有人提出氨氧化菌和亚硝酸盐氧化菌有所差异，DO浓度分别为1.0mg/L与2.0mg/L。而Michael K. Stenstrom与RichardA.Poduska在总结大量文献的基础上，通过对各种因素及双底物限制动力学进行分析，认为这些浓度之所以各不相同，主要是由于双底物限制动力学的原因，并得出结论：在较高的平均细胞停留时间（MCRT）的条件下，DO浓度为0.51.0mg/L就可完成硝化作用，MCRT较低时，完全硝化则需要相对高的DO浓度；而能够发生硝化作用的最低DO浓度约为0.3mg/L82。Kanaki,K.等通过实验发现，低的DO不会对氨的氧化产生影响，因为在低的DO（0.5mg/L）条件下，氨氧化菌的生长量会增加，恰好补偿了DO太低引起的氨氧化速率的降低。而低的DO会大大地抑制亚硝酸盐的氧化作用，因为亚硝酸盐氧化菌的生长量未增加，不能补偿由DO过低引起的亚硝酸盐氧化速率的降低，并且低的DO会加剧有机负荷对硝化作用的影响83。王建龙等也发现低的DO 0.8mg/L 会对亚硝酸盐氧化菌的生长酶系产生抑制作用，而对氨氧化菌的生长酶系则会起到促进的作用。有趣的是，好氧硝化细菌也有反硝化的能力。在大量的纯培养研究中，部分氨显示出被转化为气态的氮化合物。显然，这些气态化合物是由硝化细菌的反硝化反应所产生。这些反硝化反应的主要副产物是N284，NO85, 86或N2O87。在低的溶解氧浓度和亚硝酸盐存在的条件下，超过60的氮被转化为这些化合物88。在厌氧条件下，Nitrosomonas eutropha能够利用氢和亚硝酸盐89以及氨和NO2生长90。在这种情况下的终产物都是氮气。4光照 亚硝酸盐氧化菌对近紫外波段很敏感，其原因可能与细胞膜上的氧产生超氧化物游离基有关。但对于这一波段的光对亚硝酸盐氧化菌产生负面影响的确切原因尚未发掘。对于那些受光照影响的亚硝酸盐氧化菌，应及时的将其转移到暗区，并提供足量的供能物质，大约需要几个小时它们才能修复。5抑制剂很多化学物质能对硝化细菌产生抑制作用，如：ATU（烯丙基硫脉）、乙炔、重金属、金属鳌合剂（尤其是与铜鳌合的）、二硫化碳、游离氨、2-氯_6一三氯甲基吡啶（Nitrapyrin）等。表1-3列出了一些经常被使用的硝化细菌抑制剂。表1-3 一些常用的硝化作用抑制剂91Table 1-3 some comonely used inhibitors of nitrification抑制剂抑制对象丙烯基硫脲（ATU）亚硝酸盐氧化菌氯酸钠氨氧化菌和亚硝酸盐氧化菌2-氯-6-三氯甲基吡啶亚硝酸盐氧化菌叠氮化钠亚硝酸盐氧化菌乙炔亚硝酸盐氧化菌游离氨氨氧化菌和亚硝酸盐氧化菌亚硝酸氨氧化菌6共代谢正如前文提及的，催化亚硝酸细菌反应的是氨单加氧酶（ammoniamonooxygenase，AMO），它与甲基营养菌的甲烷单加氧酶（methanemonooxygenase，MMO）极其相似92, 93。甲烷单加氧酶能催化氧化已分解的碳氢化合物，包括卤代烃类。最近一些研究成果表明氨单加氧酶（AMO）也具有类似的功能，它能通过共代谢的途径来氧化其他非氨底物92。有人估计，亚硝酸细菌能以共代谢的途径降解其每日耗氮量十分之一的碳氢化合物。1.2.6 硝化细菌在水产养殖中的应用硝化细菌为自然界氮循环中氧化亚硝酸盐为硝酸盐的一类重要微生物1。 由于养殖水体的定期消毒，水体微生态环境遭到严重破坏，导致水产养殖过程中亚硝酸盐大面积过度积累事件频繁爆发，直接或间接造成我国水产养殖业的巨大损失, 并日益成为限制我国水产养殖进一步发展的重要因素之一。 然而，长期对水体亚硝酸盐积累现状的忽视，使得我国市面上硝化细菌产品极其匮乏（多为其他种类低效混合微生物的替代产品，如光合细菌、芽孢杆菌等），同时针对富营养化水体亚硝酸盐降解研究的缺失。因此，硝化细菌菌剂的研究与开发显得尤为重要。有关硝化细菌在水产养殖方面的报道不多，分析原因主要是硝化细菌菌剂本身价格昂贵，而且由于保质期较短大大限制了其使用范围。养殖水体中的氨氮与亚硝酸盐对水产养殖对象的毒害是非常严重的，其中，尤其是对虾养殖，近年来，由于氨氮或亚硝酸盐积累产生毒害造成大面积病害虾和死虾的现象日益频繁。在一个水产养殖系统中，氨氮和亚硝酸盐的除去通常有硝化细菌来完成。但是在一个新建的水产养殖水体中，氨氮或亚硝酸盐往往在足够的硝化细菌生成前就以积累到对养殖对象产生毒害。因此，为了缩短硝化细菌生成足够量所需的时间，人为添加硝化细菌以降低氨氮和亚硝酸盐所产生的毒害。Grommen等向养鱼池废水投加由高活性亚硝酸盐氧化菌及富集液组成的复合菌液，试验结果表明，当复合菌液的质量分数为5 mgVSS/L时可确保4 d之内对NH3 - N和NO2 - N的去除率由10 mg/L到低于可检测范围。当DO大于6 mg/L时没有检测出NO2- ，因此，投加该复合菌液表现出可靠性和可再生性。邢华等人采用纯硝化细菌直接泼洒，使得池塘中的菌体浓度达到1ppm后，在未换水的情况下，经过19天时间，亚硝态氮下降了98.6，且对虾生长状况良好。马悦欣等94研究了牙鲜自净式养殖槽水层和过滤层氨氧化菌含量分别为3.0102 m/L和2.0104 m/L，亚硝酸盐氧化菌含量是2.0102 m/L和3.0103 m/L。无循环过滤槽中氨氧化菌和硝化细菌含量为3.5103 m/L和3.5103 m/L。王国祥等95研究认为自然水体中硝化细菌分布广泛，他对同一水体不同小环境中的硝化细菌的分布作了深入的研究。Danil.S.Hagopian91综述了硝化细菌的特点，推荐开展硝化细菌水生微生态研究。养殖水体中存在的三氮（NH3N、NO2N和NO3N）中，NH3N和NO2N具有很强的毒性。王鸿泰等96研究了池塘中亚硝酸盐对草鱼的毒害作用。黄正等97利用固定化硝化细菌处理养殖废水，24小时后，COD除去率达到74.9，NH3N去除率达到82.5。C.Schuster等人用硝化细菌处理闭合循环养殖随系统，氨氮含量比对照降低了77。H.Shah和J.P.Obbard等用固定化的硝化细菌处理龙虾养殖废水，获得了理想的效果。Suny-Koo Kim等选择了适合固定化硝化细菌且具有经济利用价值的固定化材料。他们使用混合固定化的硝化细菌处理循环养殖水，获得了70 g/m3d的氨氮处理负荷。N.Sauthier等使用硝化细菌生物滤池处理循环养殖水，氨氮负荷可达到2.41 g/m3d。R.Gromman等用生物滤池也得到了相同的结果。1.3 论文研究的内容及目的1.3.1 论文选题的意义国际上公认的水体发生富营养化的限制浓度是：TN0.2 mgL，TP 0.02 mgL。根据1986年至1989年，中国第一次开展的大规模湖泊富营养化调查结果，全国26个主要湖泊、水库中TN全部高于0.2 mgL，92的水体TP超过0.02 mgL。目前许多城市和市郊的小湖已发展到富营养化及“超”富营养化状态。富营养化现象不仅出现在象湖泊这样水流缓慢的水体中，甚至在某些水浅的急流河段，河床砾石上也大量生长着藻类，出现了十分明显的富营养化现象。在我国，对虾养殖模式主要为分散式、高密度养殖模式，即小面积、分散式、高密度的投放及投喂对虾养殖模式。在这种养殖模式下，一个养殖周期所产生的总磷（TP）、总氮（TN）和固体悬浮物（TSS）分别为321,668和215,000公斤公顷。为了除去养殖过程中产生的有害物质，尤其是氨氮和亚硝态氮，几天内往往需要更换40的养殖水体，而这种富营养化的养殖废水又往往未经任何处理直接排入河流进入入海口和近海区域。这样，大大增加了近海“赤潮”发生的几率，同时大量生长的好氧生物所造成的局部缺氧环境严重的破坏了我国近海海洋生态平衡。同时由于高密度的投放饲养和投喂，导致养殖水体本身所积累的氨氮和亚硝态氮，一直是我国高密度养殖的最大问题。氨氮和亚硝态氮直接对养殖对象产生毒害，使养殖对象对病害的抵抗力降低，从而染病乃至死亡，造成水产养殖户的巨大损失。一般不同的养殖对象对氨氮和亚硝态氮的耐受浓度不同，以南美白对虾为例，非离子型氨氮的安全值为小于0.1 mgL，亚硝态氮的安全值为小于0.2 mgL。而根据我国尤其是广东地区，在整个养殖过程中，氨氮的浓度一般在0.15 mg/L左右，亚硝态氮的一般为0.20.8 mg/L左右，这样大大增加了水产养殖的风险。硝化细菌（包括氨氧化菌和亚硝酸盐氧化菌）在养殖水体中是存在的。但是，由于养殖过程中非规范性的频繁换水和不定期的消毒，往往导致水体中硝化细菌的大量流失或死亡，破坏了整个养殖水体的生态平衡，也导致了硝化细菌脱除氨氮和亚硝态氮作用的弱化乃至丧失。针对养殖废水的富营养化导致的经济损失和环境破坏，各国研究人员进行了相关研究，其中，硝化细菌菌剂的投放技术、污水工程反应器处理技术便是主要的两种处理方法。工业及市政污水处理工程中用到的污水工程反应器处理技术，大都集中应用于经济效益较好的大规模的工厂化养殖场地，这样将废水集中处理，有效地缓解了养殖水体富营养化的情况。但是由于其繁琐的处理工艺及高昂的维持费用使得其在我国分散式高密度水产养殖废水处理上难以得到应用。这种情况还出现在许多发展中国家，例如泰国、马来西亚、菲律宾和越南等地。分散的低值养殖个体户，由于区域分散、风险投资和经济效益等原因，决定了其不可能进行大规模的生物废水处理工程。因此，针对这种分散式高密度水产养殖模式，市场上出现了许多的纯“硝化细菌”产品，主要为国外及港台等地的产品，而国内这种纯“硝化细菌菌剂”产品几乎没有。即使是国外或港台的这类产品，由于价格昂贵也大都应用于观赏鱼的养殖和水族馆等场所。现今水产养殖领域有关“硝化细菌”的产品鱼目混杂，大都为混合菌群，其中绝大多数为异养厌氧微生物菌群，例如，芽孢杆菌类、乳酸菌类和光合细菌类，其本身并不是硝化细菌菌种。即使是真正的硝化细菌产品，也因为其使用方式的限制，尤其是其菌剂本身氧化性能低，保藏期短等限制，其功效也往往难以达到产品宣传的效果。我国幅员辽阔，养殖面积很广，以水产养殖净化水质的微生态制剂为例，2000年全国淡水池塘养殖面积约300万亩，若每亩水质改良剂的用量为30公斤/年，则需