代谢组学数据挖掘及分析操作SOP-.doc

代谢组学数据分析操作SOP 应用Masslynx的离线软件进行色谱峰自动识别，峰匹配（峰对齐）和归一化处理，生成biomarkers；(需较长时间,最好在台式电脑上操作比较快)1) 将生成的biomarkers导入simca-p12.0进行PCA分析，如果分的好采用此种方式，如果分的不好可进行剔除圈外点后进行PLS-DA分析，且进一步剔除圈外点（注：不是所有在圈外的点都应该剔除，选择性剔除较远点后，有的较近的点会自然落在圈内）；2) Simca-p比较适合两组间的比较，所以组数不要太多，且分的组数比每组的样本数还多是绝对不允许的；3) 在PCA或者PLS-DA生成的scores图中可以看到各组间聚集效果，可以设置相应参数。在loading图中可以生成vip值列表，挑选VIP1的化合物进行下一步分析，如果太多可以选择峰面积比值在2以上的标志物为主要标志进行下一步分析；4) 对simca-p进行的两两比较的组，同样进行t-test检验，P0.05表示有显著性差异；同时满足以上两点的化合物可作为第1轮的标志物；5) 在masslynx软件中，选择QC样本的色谱峰，对以上标志物进行峰提取，点击该图标输入分子量，按住鼠标右键,拖拉出平均分子量（我们会发现平均分子量对应的出峰时间与masslynx处理数据后的出峰时间不一样，后者是所有样品在该点出峰的平均出峰时间，而前者是输入该分子量后提出来的平均时间，因此不同，但一般在0.05的范围内偏差是可以接受的。）7） 找出提取的峰为该时间点上最强峰的离子峰（如果有二倍体峰2(M+1)-1，更有说服力），定为标志物，否则直接舍弃，可能是碎片峰或者基线波动。所有的分子量都应该提取平均的分子量,不能直接点击否则会有挺大误差.通过此步后会筛除一部分化合物，得到第2轮的标志物。注：一般1min以前的很可能是溶剂峰,可以先提取平均分子量,看下与质谱出来的分子量是否一致,一般即便去鉴别,鉴别出来的化合物也不对.不是极性不可能,就是这个化合物不可能出现在这里.首先看该峰的信噪比，定性的峰高必须是基线的3倍以上，否则直接剔除掉；如果为母粒子,一般有二倍体峰M=2(M+1)-1,如果没有,该峰前面还有更大分子量的峰,可以进行比较,看是否为常见碎片,一般相差1,18等,虽然TOF不能较彻底打碎化合物,但由于质谱的软电离,也会有简单的打碎.如果可能是碎片的就排除,如果不是碎片的可以保留,很有可能是标志物(一般标志物有多少就看QC样本的峰有多少,一般不会超过30个,即使血清有1000+个化合物,但能在UPLC-TOF中保留的并不多,而且即使有峰也不一定就是标志物).如果遇到同分异构体无法确定的,可以去google学术中看同样是尿或者血清样本的代谢组学研究，无论研究的是什么药，只要有过某一同分异构体的文献描述，且较多的，就可以相互佐证是这个标志物了。8）通过以上筛选后的化合物进行HMDB数据库筛选,选出内源性的物质作为标志物，并与masslynx软件中的I -FIT 功能，对所筛查到的具有显著性差异的代谢物进行分析，计算其可能的分子式, 一般同位素匹配度越好，质量偏差越小的化合物为正确化合物的可能性大(其实一般上述步骤筛选结束后不需要再用I-fit功能了)。这些标志物可能有同分异构体或者相同分子量的不同化合物，也有可能是含量较大的碎片峰，这是第3轮的标志物。is found in alcoholic beveragesis found in pomes/cloves/fats and oils/fishes/nuts/corn/mushroomsis a flavouring ingredientis used as a food additiveis a food flavorant/fruit flavouringis found in citrus/in milk and milk products/brassicas/green vegetables/cereals and cereal products/found in animal foodsis found in herbs and spicesis derived from bacterial or plant sourcesis only found in individuals that have used or taken this drugis isolated from leaves of Stevia rebaudiana (stevia).is a normal urinary/found in normal urineis synthetic.以上叙述的，都不用考虑，不是内源性的物质；还要看Biofluid Locations位置是否在尿样，血样或者自己所属的样本中。此外的看Origin是否是endogenous的。关于质谱测定分子量与实际分子量间的差距，一般负模式下，质谱出来的MASS，需要加上H的分子量，M（H）=1.01（具体值忘记了，总之不是1）9）将上一步所得的第三轮标志物做UPLC-QTOF二级谱打碎，通过物质的软电离打碎情况去初步验证是否为该化合物。在HMDB中去查找第3轮标志物的结构文件（.mol）并将血清及尿样的标志物分别保存在不同文件夹中，如果有同分异构体或者不能判断的均编相同号保存。二级打碎后，在相应的离子通道中提取该分子量的峰，并找到其二级谱，进过二级打碎后，母粒子的含量会减少很多，且一般不会再有二倍体峰出现。在masslynx的list界面中找到某一进样样品，点击chromatogram按钮，进入chromatogram界面，点击菜单栏中的display，点击Tic选项，处理不同的质荷比通道，选择你输入的不同通道，在图中任意位置右击就能看见你所输入的质荷比通道。然后看该质荷比在你原来色谱中出峰时间，对改峰进行右击拖拉出平均分子量，出来的就是二级谱图。再在二级谱图中，选择Tools菜单选项下的MassFragment选项,选择该质荷比的.mol文件导入，在线搜索出该质荷比物质可能的碎片结构，嫩绿色表示可能性较大，红色短线表示其断裂位置，灰色表示断掉的碎片。同分异构可以通过这样的方法去鉴别，匹配度越高，碎片重合越多，可能性越大。如果