实验药理学蛋白质研究技术.ppt

蛋白质研究技术 实验药理学2007 04 05 协和医科大学药物研究所陈乃宏 蛋白质研究技术 一 蛋白质的概要及其化学性质 一 蛋白质概要1 蛋白质概念及其生物学意义 2 蛋白质的构成 3 蛋白质的分类 二 蛋白质的化学性质 1 蛋白质的相对分子量 2 蛋白质的两性电离及等电点 3 蛋白质的胶体性质 4 蛋白质的沉淀反应 5 蛋白质的变性 6 蛋白质的颜色反应二 蛋白质的构成及构效关系 一 蛋白质的构成 1 蛋白质的1级结构 2 蛋白质的2级结构 3 蛋白质的立体结构 4 蛋白质结合的化学键 二 蛋白质的构效关系 1 蛋白质的1级结构与功能的关系 2 蛋白质的立体结构与功能的关系 三 蛋白质研究的技术及步骤 一 蛋白质研究的常用技术 1 蛋白质提取 沉淀 膜分离技术 2 蛋白质液相色谱 3 蛋白质电泳技术 4 蛋白质纯化优化及定量测定 5 蛋白质测序技术 6 流式细胞术 二 蛋白质研究的策略及一般步骤简介 1 蛋白质的确认 2 蛋白质的精制 3 精制蛋白的分析 4 蛋白质构造的解析 5 蛋白质抗体的调制 6 蛋白质分布状况的检测 7 蛋白质功能 活性 调节的研究 8 蛋白功能调节的探测 9 蛋白质机能调节的应用 四 分子药理学中常用的蛋白研究技术 1 蛋白免疫沉淀 免疫印迹 blotting 技术在药理学研究中的应用 2 细胞骨架蛋白与神经细胞的机能调节 3 蛋白图像可视技术在神经药理学研究中的应用 一 蛋白质的概要及其化学性质 一 蛋白质概要1 蛋白质概念及其生物学意义 2 蛋白质的构成 3 蛋白质的分类 二 蛋白质的化学性质 1 蛋白质的相对分子量 2 蛋白质的两性电离及等电点 3 蛋白质的胶体性质 4 蛋白质的沉淀反应 5 蛋白质的变性 6 蛋白质的颜色反应二 蛋白质的构成及构效关系 三 蛋白质研究的技术及步骤 四 分子药理学中常用的蛋白研究技术 1 蛋白质的元素组成 重量 C 50 55 H 6 9 7 3 O 25 30 N 15 18 S 0 2 5 N的含量平均为16 凯氏 Kjadehl 定氮法的理论基础 蛋白质含量 蛋白氮 6 25 一 蛋白质概要1 蛋白质概念及其生物学意义 2 蛋白质的构成 1 元素构成 2 氨基酸构成 氨基 羟基 H2N COOH H R C 侧链残基 20种 三 蛋白质的氨基酸组成 氨基酸是蛋白质的基本组成单位 从细菌到人类 所有蛋白质都由20种标准氨基酸 20standardaminoacids 组成 一 氨基酸的结构式 19种氨基酸具有一级氨基 NH3 和羧基 COOH 结合到 碳原子 C 同时结合到 C 上的是H原子和各种侧链 R Pro具有二级氨基 亚氨基酸 20种氨基酸的分类和名称 非极性侧链残基氨基酸 极性无电荷侧链残基氨基酸 极性电荷侧链残基氨基酸 Glu Gly GABA DA 去甲肾上腺素 5 HT 作为激素和神经递质被使用 有生理活性氨基酸等 所有蛋白质均是由氨基酸来组成的 L型氨基酸是由许多不同的 氨基酸按一定的序列通过酰胺键 肽键 缩合而成的 具有较稳定的构象并具有一定生物功能的大分子 2 蛋白质的构成 1 元素构成 2 氨基酸构成 要研究蛋白质的结构和功能 通常需要从某一复杂的体系中分离纯化目的蛋白 本课程是为从事蛋白质化学研究而开设的训练课程 通过学习使研究生对蛋白质化学技术有全面的了解 为以后课题研究运用这些技术打下基础 蛋白质研究策略简介 一蛋白质概要 二 蛋白质研究技术及步骤1 蛋白质的确认 2 蛋白质的精制 3 精制蛋白的分析 4 蛋白质构造的解析 5 蛋白质抗体的调制 6 蛋白质分布状况的检测 7 蛋白质功能 活性 调节的研究 8 蛋白功能调节的探测 9 蛋白质机能调节的应用 Met Ser Gly Asp Tyr Glu Asp Asp Leu Cys Arg Arg Ala Leu Ile Leu 蛋白质的结构 蛋白质的一级结构 2级结构 3级结构 4级结构 ATGTCTGGGGACTACGAAGATGACCTCTGTCGGCGGGCCCTCATCCTG 碱基排列 A adenine 腺嘌呤 Tthymine 胸腺嘧啶 Ccytosine 胞嘧啶 Gguanine 鸟嘌呤 DNA 信息基因碱基排列 ATGTCTGGGGACTACGAAGATGACCTCTGTCGGCGGGCCCTCATCCTG Met Ser Gly Asp Tyr Glu Asp Asp Leu Cys Arg Arg Ala Leu Ile Leu 碱基排列 氨基酸排列 苏 蛋白质 碱基排列决定氨基酸排列信息 ATGTCTGGGGACTACGAAGATGACCTCTGTCGGCGGGCCCTCATCCTG Met Ser Gly Asp Tyr Glu Asp Asp Leu Cys Arg Arg Ala Leu Ile Leu 碱基排列 氨基酸排列 蛋白质 如何决定其立体构造 ATGTCTGGGGACTACGAAGATGACCTCTGTCGGCGGGCCCTCATCCTG Met Ser Gly Asp Tyr Glu Asp Asp Leu Cys Arg Arg Ala Leu Ile Leu 碱基排列 氨基酸排列 如何正确制作其立体构造 如何确定蛋白质的性质和机能的不同 蛋白质 如何决定其功能 ATGTCTGGGGACTACGAAGATGACCTCTGTCGGCGGGCCCTCATCCTG Met Ser Gly Asp Tyr Glu Asp Asp Leu Cys Arg Arg Ala Leu Ile Leu 碱基排列 氨基酸排列 如何正确制作其立体构造 如何确定蛋白质的性质和机能德不同 蛋白质 氨基酸特性II氨基酸侧链残基的性质 氨基酸侧链残基的性质的重要性 蛋白质研究技术及步骤 1 蛋白质的确认 2 蛋白质的精制 3 精制蛋白的分析 4 蛋白质构造的解析 5 蛋白质抗体的调制 6 蛋白质分布状况的检测 7 蛋白质功能 活性 调节的研究 8 蛋白功能调节的探测 9 蛋白质机能调节的应用 一 蛋白质研究策略简介 蛋白质构造的解析 精制蛋白质的分析 蛋白质抗体的调制 了解蛋白质的分布 蛋白质机能调节的应用 蛋白质在防治疾病中的应用 蛋白质与疾病的关系 蛋白质的确认 蛋白质的精制 蛋白质活性的测定 蛋白质机能 活性 调节的研究 一 蛋白质的精制 1 蛋白精制的准备1 确定生物学现象相关的特定蛋白的存在 2 研究材料的确定 3 检测方法的选择确定 4 蛋白质安定化条件的研究 2 蛋白质的提取和分离1 细胞的分离2 细胞的溶解3 蛋白质的可溶化4 蛋白质的浓缩透析 蛋白质研究技术及步骤 策略 简介 3 蛋白质的分离与精制1 柱色谱法 columnchromatography LPLC IPLC HPLC2 亲和色谱法 affinitychromatography ligand 特异的物质结合 配体结合 3 其它色谱法4 电泳精制法5 各种精制法的组合离子交换色谱法 ion exchange 载体凝胶色谱法 gelfiltration 逆相色谱法 4 重组蛋白的发现和精制利用cDNA来进行蛋白质的构造和机能的研究有非常好的优点 因此 现代分子生物学方面 常常利用某种cDNA的蛋白表达株 制备足够量的蛋白进一步对其生理活性和立体构象进行分析 或者改变cDNA来制作变异的蛋白并对其进行解析 可以解明某一蛋白在其原有组织中的生理作用 在重组DNA时应把DNA片段连在适当的质粒 或者噬菌体 上 转入细胞进行DNA片段的克隆或物质生产 在这种情况下把质粒称为载体 运载质粒的细胞称为宿主 1 宿主载体的选择 其精制主要用载体 carrier 蛋白的方法结合特异性亲和色谱法来精制 如 GST法 MBP法 TRX法 还可用His tag FLAG tag法进行 宿主载体的选择 大肠杆菌 用大肠杆菌为宿主是安全性 时间性 经济性和操作难易程度都非常好 适用于对目的蛋白进行大量的制备 多数情况下 能以融合蛋白的方式被表达并容易用亲和色谱法来精制 但其缺点是有时蛋白会在包涵体 inclusionbody 内 以不溶性的状态被表达 这时必须用某种办法将蛋白从包涵体内溶解出来 当然也可以重新考虑改选其它质粒的办法 用大肠杆菌还有一个缺点就是对产生的蛋白几乎不进行真核细胞那样的翻译修饰 post translationalmodification 如糖链修饰 磷酸化 乙酰化 脂质附加 1999年11月 Nature 杂志发表了一篇文章中报道了在大肠菌胞质中的2500种多肽链种 只有300种以分子伴侣来帮助其折叠成正确构象 2 重组蛋白的精制 酵母 优点是复制的载体质粒都比较经济 省时 可大量制备 且可象真核细胞内一样对蛋白进行糖链 磷酸化等修饰 缺点是对表达蛋白提取时需要进行细胞壁的破碎 注意 有时产生的糖链修饰与动物细胞内修饰不一致 动物细胞 优点 可与动物来源的蛋白质一样进行表达 翻译表达后的修饰方面基本一致 适用于药理学或分子生物学基础研究 但大量表达有困难 在时间 经济性和操作的难易度方面比大肠菌复杂 因而不适合大量制备 昆虫 是由蛾的一种被病毒感染的DNA插入cDNA中用蛾的卵巢细胞株SF9或SF21为宿主来转染表达蛋白质 最大优点是 表达的蛋白具有正常正常的生理活性 与动物细胞翻译后修饰相近 表达量比动物细胞多 但是实验操作复杂 二 精制蛋白的分析 1 蛋白的定量 UV法 BCA法 SDS PAGE法 转膜后定量分析法 CBB染色法 0 01 0 1 g 银染法 化学发光法 ECL 2 纯度和分子量的测定 纯度 电泳 二次电泳 FPLC HPLC法 分子量 电泳测分子量 gel过虑法 质量分析法 MS 3 蛋白质组成的分析 1 氨基酸的分析 将蛋白或肽加水分解为氨基酸 通常用专用的氨基酸检测仪器进行分析 2 蛋白水解酶分析 用蛋白酶将蛋白分解后再将生成物用MSMALDI TOF进行分析 不仅用于对预想蛋白的一次构造进行验证 也对没有确定的蛋白进行确认 3 肽质谱分析 用蛋白酶分解后测定各个肽链的质量来了解修饰构造相关信息 4 翻译后修饰的测定与分析 1 磷酸化法的分析 同位素法 测定蛋白质的磷酸化情况 用抗体分析蛋白质的磷酸化情况 用SDS PAGE western法测定磷酸化的状态 磷酸氨基酸分析 分析磷酸化的氨基酸是苏 丝 还是酪氨酸 采用基因敲除的办法测定磷酸化的部位 2 糖链修饰的分析 蛋白上的糖链分为与天冬酰胺结合的N 结合型糖和与苏氨酸 丝氨酸结合的O 结合型糖链和与蛋白聚糖结合的糖胺聚糖 GAG 为了分析这些成分常用的方法有 切断糖链 用糖分解酶或化学处理的方法在糖链根部把糖链切除 分析单糖 加水分解单糖 用HPLC或MS确定糖的成分 糖链构造确定 用MS和NMR对N 结合型糖的主体构造确认 3 脂质的分析法 对糖脂质的脂质修饰部分进行解析和测定 1蛋白一级构造的解析 蛋白内部氨基酸排列的解析 蛋白C末端构造的解析 蛋白N末端构造的解析 相同蛋白的检索 利用网络从数据库中检索比较相同 相近一级结构的蛋白 2蛋白立体构造的解析 蛋白质结晶化法 主体构造解析法 利用X光衍射 NMR 电镜等 蛋白主体构造的表示 显示 用RasMol等蛋白软件在电脑上展示蛋白的主体构象 立体构象的数据库检索 利用网络数据库等专门网站有 http www proteomeworks bio 蛋白质组研究技术 信息等 从新药开发角度 发现新蛋白及新作用 http www proteome med umich edu可以找到蛋白质组研究相关企业 各种仪器来源 新闻等 http www proteome co uk各种蛋白质组研究相关信息http www micromass co uk介绍蛋白质鉴定的先进仪器http www expasy ch蛋白质鉴定专家系统 SwissInstituteofBioinformaticshttp expasy proteome org au蛋白质鉴定专家系统 AustralianProteomeAnalysisFacilityhttp expasy cbr nrc ca蛋白质鉴定专家系统 CanadianBioinformaticsResours 三 蛋白质构造的解析 四 目的蛋白抗体的调制 1 抗体研制的注意事项 抗原的动物种和免疫动物的关系 抗原的设计 抗体的种类单抗多抗 2 抗原的调制 肽的合成 载体的合成 抗体效价的检测ELISA法 RIA法 荧光法 最常用的是ELISA法 3 抗体的精制 与蛋白精制的原理相同 5 蛋白质分布状况的检测 1 用原位 insitu 法对蛋白质的检测 利用抗体进行检测 利用活性进行检测 直接注入标记后的蛋白质 荧光融合蛋白的方法检测 2 用invitro法对组织 细胞 体液培养上清蛋白的检测 体液 血液 尿液 脑脊液的检测 3 细胞内分布 移动 分泌机制的解析 了解蛋白是位于膜上膜内及其在蛋白质内的移行情况 六 蛋白质功能 活性 调节的研究 1对酶类蛋白质活性的检测2受体蛋白信号传导因子 3细胞骨架蛋白 4基因调节因子 5细胞外分泌蛋白 6细胞接合分子 七 蛋白功能调节的探测 1翻译后的调节的研究 2通过蛋白质相互作用对功能调节的研究 3通过蛋白质位移变化调节的研究 4对主要信号纯度通路关联性的研究 第二信使的解析 GTP结合蛋白的解析 磷酸化 去磷酸化酶的解析 八 蛋白质机能调节的应用 1 蛋白质与疾病的关系 2 蛋白质在防治疾病中的应用对人类而言 蛋白质的研究最终要服务于人类的健康 主要指促进分子医学的发展 如寻找药物的靶分子 很多药物本身就是蛋白质 而很多药物的靶分子也是蛋白质 药物也可以干预蛋白质 蛋白质相互作用 01年在瑞士成立的GeneProt公司 是由以蛋白质组数据库 SWISSPROT 著称的蛋白质组研究人员成立的 以应用蛋白质组技术开发新药物靶标为目的 建立了配备有上百台质谱仪的高通量技术平台 蛋白质组 proteome 一词 源于蛋白质 protein 与基因组 genome 两个词的杂合 意指 一种基因组所表达的全套蛋白质 即包括一种细胞乃至一种生物所表达的全部蛋白质 虽然第一次提出蛋白质组概念是在1994年 但相关研究可以追溯到上世纪90年代中期甚至更早 尤其是80年代初 在基因组计划提出之前 就有人提出过类似的蛋白质组计划 当时称为HumanProteinIndex计划 旨在分析细胞内的所有蛋白质 但由于研究技术等种种原因 这一计划被搁浅 90年代初期 各种技术已比较成熟 特别是二维电泳和质谱技术的组合 为掌握蛋白质表达规律提供条件 在这样的背景下 才又提出蛋白质组这一概念 蛋白质组 以DNA序列分析技术为核心的基因组研究技术推动了基因组研究的发展 而以基因芯片技术为代表的基因表达研究技术为科学家了解基因表达规律提供依据 在蛋白质组研究中 二维电泳和质谱技术的黄金组合又为科学家掌握蛋白质表达规律提供条件 但蛋白质研究技术远比基因技术复杂和困难 不仅氨基酸残基种类远多于核苷酸残基 20 4 而且蛋白质有着复杂的翻译后修饰 如磷酸化和糖基化等 给分离和分析蛋白质带来很多困难 当前蛋白质组研究的核心技术就是双向凝胶电泳 质谱技术 即通过双向凝胶电泳将蛋白质分离 然后利用质谱对蛋白质逐一进行鉴定 蛋白质组特征 一 蛋白质研究策略简介 二 常用研究蛋白活性技术 免疫沉淀 蛋白免疫印迹 blotting 技术在药理学研究中的应用 一 原理方法1 原理 利用蛋白质间相互作用的特性 借助proteinA 或proteinG Sepharose从细胞或组织的蛋白质混合液中 将一种目的蛋白质进行免疫沉淀 或将一种已知的特异性结合蛋白质免疫沉淀 进一步用western方法将其分离 免疫沉淀 蛋白免疫印迹 blotting 技术在药理学研究中的应用 重点掌握内容 ProteinaseInhibitors100mMPMSF inEtOH