微生物检验作业作业指导书..doc

XXXXXXXX有限公司作 业 文 件文件编号微生物检验作业指导书版本号页 码1 目的通过对微生物检测流程的规范确保检验工作有序进行。2 范围 适用于微生物检测的全过程。3 职责3.1 检验人员严格按检测流程做好各项工作。3.2 检测主管做好监督检查工作。4 内容4.1 准备工作4.1.1 卫生清洁 整理普通检验室内的各类检验物品，检查工作台面和地面卫生。4.1.2样品收集登记4.1.2.1与收样员沟通，确定检样品种、数量（如仓库到货的茶原料、内包膜，车间生产的半成品、成品，研发样品，采购样品，稳定性试验的样品、定期跟踪检测的样品）。4.1.2.2与质保员沟通，确定检样品种、数量（如自来水、纯水、一楼生产过程跟踪的各阶段液体）。4.1.2.3 按检测计划自行确定的检样品种、数量（如工作间空气、设备内表面、员工手部）。4.1.2.4各项确定后，收集并登记样品。4.1.3检测方法的确定4.1.3.1样品收集后进行分类，确定样品的检测方法，若无方法的要尽快上报或查找相关方法。4.1.3.2微生物各项目所采用的检测方法（见附表1）4.2 试剂配制、物品包扎4.2.1玻璃容器的包扎：灭菌前器皿应包扎紧密完整后才进行灭菌，以防止灭菌后器皿受到污染。4.2.2平皿、吸管按量分成若干单元用牛皮纸、报纸包扎；4.2.3试管及三角瓶应塞硅胶塞，在瓶口再用报纸包扎；4.2.4其它玻璃或金属取样工具也要用报纸包扎；4.2.5生理盐水按氯化钠加水比例0.84%配制；平板计数琼脂（PCA）、孟加拉红、月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤（LST）、煌绿乳糖胆盐肉汤（BGLB）则以标签上规定的比例进行配制。按需要量分装成于不同规格的容器中。4.3 高压灭菌4.3.1培养基及器皿的灭菌：4.3.1.1高压蒸汽灭菌：金属器具、玻璃器皿、基础培养基及其它耐热物品均放入锅内灭菌。4.3.1.2灭菌参数：121(0.1034MPa)，1520min；4.3.2染菌培养物：121(0.1034MPa),30min;4.3.3含糖类不耐热培养基(按试剂要求)：115（0.0727MPa）,1520min。4.3.4每次灭菌时均须将灭菌指示带置于灭菌锅内，观察灭菌效果。4.3.5灭菌锅的使用：参照“仪器使用维护保养作业指导书”的相关内容执行。4.4 烘干高压蒸汽灭菌后的物品除培养基及稀释液外的其他物品，如玻璃平皿吸管、金属器具或棉花等均应先置于105烘箱内，根据包装大小应保持1h以上，至干燥后使用。4.5贮存4.5.1灭菌后处理：灭菌后物品，注意放置场所，严禁与未灭菌物品混放,以免再度污染。4.5.2灭菌合格的培养基及稀释液先贮存于消毒柜，臭氧消毒并低温烘干瓶口包扎纸，存放一般不超过24h，当天未使用完的置于4冰箱存放，3天内使用完。培养基及稀释液的配制数量应以适量为宜。4.5.3烘干后合格的灭菌物品应存放于贮藏室或消毒柜内,灭菌后保存最长不得超过3天。4.5.4包装损坏或塞子脱落者，不可作为无菌品使用。4.6 无菌室的消毒4.6.1超净台的使用4.6.1.1使用前应先用75%酒精棉擦拭台面，再打开超净配备的紫外灯，照射时间不少于30min；4.6.1.2使用时,应关闭紫外灯,打开日光灯,同时打开无菌风直至实验结束；4.6.1.3超净台灭菌效果应以落菌实验加以验证；4.6.2无菌间使用前后应将门关紧，打开悬吊式紫外灯消毒，应选用30W,距离在10m处，照射时间不少于30min；4.6.3缓冲间的使用：微检员工作时穿的衣帽、鞋等物品需放置在缓冲间。并于实验前后打开紫外灯，照射时间不少于30min。4.7 检测过程4.7.1操作过程要求无菌；4.7.2进入缓冲间后用75%的酒精棉球消毒双手，换上已消毒的专用工作服、帽、口罩及鞋；4.7.3接种样品时，应再用75%的酒精棉球消毒双手；4.7.4检品须称量的要保证重量准确，且要尽快加入至稀释液中；4.7.5检样液瓶口应尽快塞紧硅胶塞，将其样液充分摇匀；4.7.6从包装中取出吸管时，尖端不能触及外露部位，使用吸管接种于试管或平皿时，吸管尖端不得触及试管或平皿；4.7.7接种样品、转种细菌必须在酒精灯前操作，吸管从包装中取出后及打开试管塞都要通过火焰灭菌。接种环和接种针在接种细菌前后应经火焰灼烧全部金属丝，必要时要烧到环和针的连接处。火焰灭菌的有效范围以火焰为中心半径9cm内。4.7.8倾倒培养基至平皿中摇匀放置；4.7.8检品检测完毕时，要求做空白对照；4.7.9不同检品要根据各自特性综合考虑，如选择的检测项目、稀释度等（附表1的相关内容）；4.7.10打开包装未使用完的器皿，放置后再使用应重新灭菌；4.8 记录 按检品的种类、检测项目、稀释度进行登记，注明编号。4.9培养4.9.1冷却后的平板及已接种的稀释培养液（如菌落总数、大肠菌群）置入37恒温培养箱培养48h；4.9.2冷却后的平板（如霉菌）则置入28恒温培养箱培养5天；4.9.2培养温度时间按不同检测项目进行确定，置入前均须检查培养箱温度是否符合要求。4.10 结果报告4.10.1按品种、检测项目查记录后，确认达到规定培养时间的培养物，取出进行计数；4.10.2计数方法按附录1中不同检测项目规定的内容执行；4.11 清洗4.11.1器皿的清洗：凡被污染的器皿，应先经过121，30min高压蒸汽灭菌后再进行清洗。4.11.2日常使用后的容器、平皿等经水冲洗或超声波清洗干净。4.11.3清洗后要求烘干或晾干备用。4.12 卫生清洁消毒 按化验室卫生管理制度、微生物检定室管理制度的相关内容执行。5 卫生检测5.1微生物涂抹实验5.1.1实验试剂：0.84%灭菌生理盐水；5.1.2实验仪器：试管、灭菌镊子、灭菌棉球：体积为333cm3、酒精灯5.1.3 准备工作：配制0.84%生理盐水分装在一定数量试管中，每管10ml，灭菌后待用；5.1.4 样品采集：5.1.4.1 设备及容器具取样： 在酒精灯火焰上方，以无菌镊子镊取无菌棉球沾润灭菌生理盐水，反复擦拭需采集样品物体表面约30cm2，然后将该棉球迅速装入盛有10ml的灭菌生理盐水试管中，摇匀待用；5.1.4.2内包装材料取样： 在酒精灯火焰上方，以无菌镊子镊取无菌棉球沾润灭菌生理盐水，以无菌操作方式于无菌操作台内反复擦拭内包装材料表面，再将擦拭后的棉球装入盛有10ml的灭菌生理盐水试管中，摇匀待用；5.1.4.3操作人员手菌取样：在酒精灯火焰上方，以无菌镊子镊取无菌棉球沾润灭菌生理盐水，用此棉球反复擦拭待测人员左手（或右手），然后棉球迅速装入盛有10ml的灭菌生理盐水试管中，摇匀待用；5.1.5 样品检测：将带有检测棉球的生理盐水在微生物无菌室按4中相关内容操作。5.1.6 计算方法：5.1.6.1设备、容器具与内包装材料（涂抹法）：菌落总数（cfu/cm2）=平皿上菌落的平均数样液稀释倍数10/305.1.6.2：人员手部（涂抹法）：菌落总数（cfu/只手）=平皿上菌落的平均数样液稀释倍数10/25.2 落菌实验5.2.1实验试剂：营养琼脂；5.2.2实验仪器：平皿、高压蒸汽灭菌锅、恒温培养箱5.2.3 实验步骤：5.2.3.1 在微生物检验室内将灭菌好的凉至45左右的营养琼脂倒入灭菌平皿内，每皿约15-20ml，待琼脂凝固后，将平皿翻转，待用；5.2.3.2 生产车间环境落菌检测的操作方法： 生产车间灭菌后或生产进行中进行测试。将5个装有营养琼脂的培养皿（直