干扰素生产工艺ppt.ppt

重组人干扰素生产工艺 主要内容 干扰素概述基因工程假单胞杆菌的构建与保藏干扰素的发酵工艺过程干扰素的分离纯化工艺过程 1 干扰素概述 干扰素的种类干扰素的理化性质干扰素的生物学活性干扰素的临床应用干扰素的生产工艺路线 1 1干扰素的种类 概念 interferon IFN 干扰素是一种细胞因子 它是机体感染病毒时 宿主细胞通过抗病毒应答反应 而产生的一组结构类似 功能相近的低分子糖蛋白 英文名称为Interferon 简称IFN 发现 干扰素是1957年英国科学家Isaccs等发现的 他们把灭活的流感病毒作用于小鸡细胞 结果发现这些细胞产生了一种可溶性物质 这种物质能抑制流感病毒 并且能干扰其它病毒的繁殖 因此 他们将这种物质称为 干扰素 以后科学家们进一步发现 机体对入侵的异种核酸 包括病毒 都产生干扰素以进行防御 当机体细胞受到病毒感染时 机体细胞产生干扰素 干扰病毒复制 它是机体抗病毒感染的防御系统 天然干扰素分类 1 根据来源 基因序列和氨基酸组成分类I型干扰素 IFN IFN IFN IFN 来源 白细胞 成纤维细胞 病毒感染的组织细胞等功能 抗病毒感染 抗肿瘤生长免疫调节 较弱 其中IFN 为多基因产物 有23种以上的亚型 II型干扰素 干扰素 IFN 来源 活化的T细胞和NK细胞产生功能 免疫调节提高单核巨噬细胞 树突状细胞的抗原提呈能力增强Tc细胞和NK细胞的杀伤活性抑制TH2细胞形成 下调体液免疫应答趋化作用抗病毒和抗肿瘤作用 次要 2 根据动物来源确定分类 例如人干扰素 HuIFN 小鼠干扰素 MuIFN 上市重组干扰素 2a 2b 1b 1b 1992年我国第一个基因工程药物IFN 1b获得国家一类新药证书 研发中的重组干扰素 IFN 临床阶段 1 2干扰素的理化性质 143 166aa MW 18 40ku pI 6 5 7 5 乙醚 氯仿敏感容易吸附玻璃 淀粉 醋酸纤维膜 琼脂和塑料等介质 型干扰素具有广谱的抗病毒活性 对多种病毒如DNA病毒和RNA病毒均有抑制作用 但这种效应不是直接的 而是通过对宿主细胞的作用引起的 对干扰素敏感的细胞表面存在于干扰素受体 核内有 抗病毒蛋白 基因 受干扰素作用后该基因活化 产生的抗病毒蛋白可阻止病毒mRNA翻译 并促进病毒mRNA降解 干扰素能提高细胞表面MHC 类分子的表达水平 受到病毒感染的细胞表面MHC 类分子的增加有助于向Tc细胞递呈抗原 引起靶细胞的溶解 干扰素可增强NK细胞对病毒感染的杀伤能力 1 3干扰素的生物学活性 正常情况下组织或血清中不含干扰素 只有在某些特定因素的作用下才能诱使细胞产生干扰素 1 3 1广谱抗病毒活性机制 病毒复制 抑制病毒复制 信号转导 IFN a IFN 诱导蛋白 诱导刺激 胞核 胞核 抗肿瘤作用机制 型干扰素能抑制细胞的DNA合成 减慢细胞的有丝分裂速度 这种抑制作用有明显的选择性 对肿瘤细胞的作用比对正常细胞的作用强500 1000倍 另外 型干扰素也可通过增强机体免疫机制 加强免疫监督功能来实现其抗肿瘤效应 免疫调节活性机制 免疫调节作用表现在对宿主免疫细胞活性的影响 如对巨噬细胞 T细胞 B细胞和NK细胞等均有一定作用 对巨噬细胞的作用 IFN 可使巨噬细胞表面MHC 类分子的表达增加 增强其抗原递呈能力 此外还能增强巨噬细胞表面表达Fc受体 促进巨噬细胞吞噬免疫复合物 抗体包被的病原体和肿瘤细胞 对淋巴细胞的作用 干扰素对淋巴细胞的作用较为复杂 可受剂量和时间等因素的影响而产生不同的效应 在抗原致敏之前使用大剂量干扰素或将干扰素与抗原同时投入会产生明显的免疫抑制作用 而低剂量干扰素或在抗原致敏之后加入干扰素则能产生免疫增强的效果 在适宜的条件下 IFN 对B细胞和CD8 T细胞的分化有促进作用 但不能促进其增殖 IFN 能增强TH1细胞的活性 增强细胞免疫功能 但对TH2细胞的增殖有抑制作用 因此抑制体液免疫功能 IFN 不仅抑制TH2细胞产生IL 4 而且抑制IL 4对B细胞的作用 特别是抑制B细胞生成IgE 对其它细胞的作用 IFN 对其他细胞也有广泛影响 刺激中性粒细胞 增强其吞噬能力 活化NK细胞 增强其细胞毒作用 使某些正常不表达MHC 类分子的细胞 如血管内皮细胞 某些上皮细胞和结缔组织细胞 表达MHC 类分子 发挥抗原递呈作用 使静脉内皮细胞对中性粒细胞的粘附能力更强 且可分化为高内皮静脉 吸引循环的淋巴细胞 1 4重组干扰素的临床应用 广谱抗病毒活性 rhuIFN 慢性乙型 丙型 丁型肝炎 疱疹 病毒性角膜炎 直接抗肿瘤活性 rhuIFN 毛细胞和慢性髓样白血病 Kaposi肉瘤 非霍奇金淋巴瘤 免疫调节活性 治疗慢性肉芽肿瘤 rhuIFN 多发性硬化症rhuIFN 1 5 干扰素生产工艺路线 1 体外诱生干扰素制备工艺 Sendai病毒诱导人白细胞1989年 IFN n3 Alferon 批准上市产量低 1gIFN 需要3亿ml人血白细胞来源困难 工艺复杂 收率低 价格昂贵潜在的血源性病毒污染的可能性 干扰素生产工艺路线 2 人源转化细胞系培养生产工艺 1999年 IFN n1 Wellferon 批准用于临床 优点 首次实现大规模商业化生产 缺点 活性低 退出临床应用 干扰素生产工艺路线 3 上市产品 重组人干扰素rhuIFN1986 rhuIFN 2a rhuIFN 2b 1990 rhuIFN 1b 1993 rhuIFN 1b 2001 2002 PEG化IFN PEG Intron Pegasys表达产物 无糖基化 N met 无活性包涵体工艺特点 发酵过程 随后变性 复性过程 基因工程大肠杆菌发酵生产工艺 干扰素生产工艺路线 4 上市产品 rhuIFN 1a1996 Avonex Biogen 2002 Rebif Serono 表达产物 166aa糖基化蛋白 22 5ku工艺特点 分泌表达 产量低 成本高 过程严格 动物无限细胞系培养生产工艺 干扰素生产工艺路线 5 宿主 腐生型假单胞杆菌 Pseudomonasputida 上市产品 IFN 2b 安福隆 表达产物 无糖基化可溶性蛋白质 具有天然分子结构和生物活性 工艺特点 发酵周期短 几个小时无需变性 复性过程 获得有活性产品纯化过程 淘汰抗体亲和层析 基因工程假单胞杆菌发酵生产工艺 2 基因工程假单胞杆菌的构建与保藏 基因工程假单胞杆菌菌种建立基因工程假单胞杆菌菌种特性菌种库的建立与保藏 2 1 基因工程假单胞杆菌菌种建立 第一步 干扰素 2b基因的克隆第二步 表达载体的构建第三步 工程菌的构建 第一步 干扰素基因的克隆 RT PCR 制备白细胞 病毒诱导 分离mRNA 反录酶合成cDNA PCR 基因连接质粒 转化E coli 筛选鉴定克隆 测序 编码人IFN 2b基因序列 501bp 165aa 第二步 表达载体构建 IFN基因与表达载体连接 转化大肠杆菌 筛选阳性克隆 获得序列正确表达载体 第三步 工程菌构建 转化假单胞杆筛选高表达 稳定遗传的工程菌获得原始菌种 2 2基因工程菌的特性 1 具有宿主菌的特征 细菌 革兰氏阴性菌 有荚膜 无芽孢 杆状 菌落 直径2 5 3 0mm 灰绿色半透明状 粘稠 生化特性 Ser L Val D L Arg和L Thr为 2 工程菌的特征 SmR TcR ApR 3 具有生产干扰素能力 放射性免疫学效价不低于2 0 109IU L 2 3菌种库的建立与保藏 QC 菌种特性 生产能力 质粒稳定性 菌种检查合格后 方可投产 2020 3 18 25 可编辑 3 干扰素 2b的发酵工艺过程 3 1摇瓶培养 取保存工作种子批菌种 室温融化摇瓶培养 30 pH7 0 250r min 18 2h检测 OD值和发酵液杂菌检查 3 2种子罐培养 接种 接入50L种子罐 接种量10 培养 30 pH7 0 控制 级联调节通气量和搅拌转速DO为30 3 4h OD 4 0 检测 显微镜和LB培养基划线检查 控制杂菌 3 3发酵罐培养 接种 通入300L培养基的发酵罐 接种量10 控制 级联调节通气量和搅拌转速 前4h 30 pH7 0 DO为30 4h后 20 pH6 0 DO为60 5 6 5h 终点控制 OD值达9 0 1 0 5 冷却水快速降温至15 以下 检测 发酵液杂菌检查 3 4 菌体收集 连续流离心机 冷却的发酵液 16000r min离心收集 菌体保存 20 冰柜 不超过12个月 检测 干扰素含量 菌体蛋白含量 菌体干燥失重 质粒结构一致性 质粒稳定性 4干扰素的分离纯化工艺过程 4 1 干扰素分离工艺过程4 2 干扰素的纯化工艺过程 4 1干扰素 2b分离工艺过程 菌体裂解预处理初级分离 1 菌体裂解 裂解缓冲液 纯化水配制 2 10 pH7 5 使用保护剂 EDTA PMSF 破碎 20 菌体 2厘米以下的碎块搅拌 加裂解缓冲液 2 10 2hr冻融 细胞完全破裂 释放干扰素 2 预处理 沉淀 加絮凝剂聚乙烯亚胺 2 10 搅拌45min 对菌体碎片进行絮凝 加凝聚剂醋酸钙溶液 2 10 搅拌15min 对菌体碎片 DNA等进行沉淀 3 离心 连续流离心机 2 10 16000r min收集上清液 含有重组干扰素蛋白质杂质沉淀 121 30min蒸汽灭菌 焚烧处理 4 初级分离 盐析 4M硫酸铵 2 10 搅匀 静置过夜 离心 连续流离心机 16000r min保存 收集沉淀 粗干扰素 4 保存 4 2 干扰素纯化工艺过程 溶解粗干扰素沉淀与疏水层析阴离子交换层析与浓缩阳离子交换层析与浓缩凝胶过滤层析无菌过滤分装 1 溶解粗干扰素 配制纯化缓冲液 超纯水 pH7 5磷酸缓冲液 0 45 m滤器和10ku超滤系统 百级层流下收集 冷却至2 10 检查 缓冲液的pH值和电导值 溶解 2 10 匀浆 完全溶解 2 沉淀与疏水层析 等电点沉淀 1 磷酸调节至pH5 0 沉淀杂蛋白 离心收集上清液 疏水层析 干扰素吸附在疏水层析柱中除非疏水性蛋白洗脱与收集 0 01M磷酸缓冲液 pH8 0 等电点沉淀 2 磷酸调节pH4 5 调节电导值40ms cm 2 10 静置过夜超滤 1000ku超滤膜过滤 除去大蛋白 透析除盐 调整溶液pH8 0 电导值 10ku超滤膜 0 005M缓冲液 3 阴离子交换层析与浓缩 0 01M磷酸缓冲液 pH8 0 平衡树脂 盐浓度线性梯度5 50ms cm进行洗脱 配合SDS PAGE收集干扰素峰 浓缩 调整溶液和电导 10ku超滤膜 0 05M醋酸缓冲液 pH5 0 中透析 4 阳离子交换层析与浓缩 用0 1M醋酸缓冲液 pH5 0 平衡树脂 上样 相同缓冲液冲洗 盐浓度线性梯度5 50ms cm进行洗脱配合SDS PAGE收集干扰素峰 浓缩 10ku超滤膜进行 5 凝胶过滤层析 洗涤液 0 15MNaCl的0 01M磷酸缓冲液 pH7 0 清洗系统和树脂上样 相同缓冲液进行洗脱 合并干扰素部分 6 无菌过滤分装 0 22 m滤膜过滤干扰素溶液分装 20 以下的冰箱中保存 7 检测项目 干扰素鉴别试验干扰素效价测定蛋白质含量 纯度测定 分子量宿主残余蛋白 残余DNA干扰素结构鉴定 紫外光谱 肽谱 N端序列其他 热原 内毒素 残留抗生素 相关药物国内生产企业 1 1b干扰素中国预防医学科学院卫生部长春生物制品研究所卫生部上海生物制品研究所深圳科兴生物制品有限公司 赛若金 2 人 2a干扰素卫生部长春生物制品研究所广州医学院沈阳三生制